周 芳 徐劍秋 安娟艷 蔣洪毛 王珍熹 張?zhí)煨?李開隆

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

短瓣金蓮花(TrolliusledebouriReichb.)為毛茛科(Ranunculaceae)金蓮花屬(Trollius)多年生草本植物，生于海拔110～900 m的草甸、林間草地或者河邊，主要分布在黑龍江、內(nèi)蒙古、長白山余脈等地及俄羅斯西伯利亞東部[1]。短瓣金蓮花主要含有黃酮、苯乙素、有機酸及酯類等成分，具有清熱解毒、消腫明目等功效，用于治療呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎和支氣管炎等[2]。近年來,野生短瓣金蓮花資源因大量采摘而受到嚴(yán)重破壞，因此加強對野生短瓣金蓮花資源的收集、保存和繁殖利用，具有重要意義。但是，由于短瓣金蓮花種子小且有胚后熟休眠的特性，出苗困難。目前國內(nèi)有關(guān)金蓮花屬植物的研究多集中在金蓮花的種子萌發(fā)[3～4]、播種育苗[5]及離體培養(yǎng)[6～7]方面，而關(guān)于短瓣金蓮花組織培養(yǎng)的研究尚未見報道。本研究以野生短瓣金蓮花種子為初始材料，利用赤霉素打破休眠促進(jìn)萌發(fā)，獲得短瓣金蓮花無菌苗，然后剪取其根莖及以上部分形成的不定芽為外植體，采用正交設(shè)計方法研究不同培養(yǎng)基類型、6-BA和NAA濃度對短瓣金蓮花增殖的影響，不同培養(yǎng)基類型、IBA和NAA濃度對生根的影響，建立了短瓣金蓮花組織培養(yǎng)體系，為短瓣金蓮花優(yōu)良品種保存和快速擴繁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為大興安嶺加格達(dá)奇地區(qū)的野生短瓣金蓮花種子，由加格達(dá)奇市林業(yè)局提供。

1.2 方法

1.2.1 種子無菌萌發(fā)與初始培養(yǎng)

取低溫儲藏的短瓣金蓮花種子分別置于300、400、500、600、700 mg·L-1的GA3溶液中浸泡，浸泡時間為24、48和72 h。每種處理0.1 g。將經(jīng)浸泡的種子分組用0.1%的HgCl2滅菌，渦旋混勻器處理10、20和30 min。滅菌后用無菌水沖洗種子5遍，在超凈臺上將種子接種至MS培養(yǎng)基，每種處理接種3盤(重復(fù)3次)。每天觀察感染菌和發(fā)芽情況，20 d后進(jìn)行發(fā)芽率的統(tǒng)計計算。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

選擇長勢良好、均一的無菌幼苗，剪去根系，將根莖及以上部位的幼苗(2 cm左右的高度)作為外植體，采用L16(43)正交設(shè)計，探討培養(yǎng)基類型、6-BA、NAA 3因素4水平組合對金蓮花增殖的影響，40 d記錄幼苗株高和抽莖數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)

以短瓣金蓮花組培增殖苗為材料，將之接種到含不同基本培養(yǎng)基類型、不同IBA、NAA濃度的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。每天觀察其生根狀況。20天以后，測定其不定根的長度和數(shù)量。

上述培養(yǎng)基內(nèi)均含有蔗糖25 g·L-1，瓊脂6.0 g·L-1，pH值5.8，121℃高溫滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度控制在22～25℃，濕度60%～70%，光照強度2 000 Lx，光照時間16 h·d-1。

1.3 煉苗與移栽

當(dāng)組培苗生根且長到2～3 cm高時，在室外煉苗，移栽至穴盤。煉苗方法：將生長健壯、根系發(fā)達(dá)的短瓣金蓮花組培苗開蓋放置2天(使其逐步適應(yīng)無菌到有菌、由恒溫到變溫等變化)，注入少量無菌水。2天后，用鑷子將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，用稀釋1 000倍的多菌靈溶液清洗后用清水沖洗，洗去根部培養(yǎng)基，盡量避免傷及根系。栽培在高溫滅菌V草炭土∶V珍珠巖∶V蛭石=3∶1∶1的土壤基質(zhì)為最佳。移栽后，用干凈的培養(yǎng)瓶罩在移栽苗上放置1周，澆水保持土壤含水量25%左右，1周后將培養(yǎng)瓶取下即可，對其成活率進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA3濃度和滅菌時間對短瓣金蓮花種子萌發(fā)的影響

由表1可以看出，GA3濃度對短瓣金蓮花種子發(fā)芽率的影響達(dá)極顯著水平，GA3浸泡時間和0.1% HgCl2滅菌時間對短瓣金蓮花種子發(fā)芽率的影響也都達(dá)到了顯著水平；另一方面，GA3濃度、浸泡時間和0.1% HgCl2滅菌時間對短瓣金蓮花種子染菌率的影響都達(dá)到了顯著或極顯著水平，說明GA3處理不僅促進(jìn)了短瓣金蓮花種子的萌發(fā)，增強了萌發(fā)活力，而且降低了染菌率。

對6種濃度GA3溶液進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)(表1)，500和600 mg·L-1GA3處理的種子發(fā)芽率與300 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率差異顯著，與0 mg·L-1差異極顯著，與400和700 mg·L-1GA3處理的種子發(fā)芽率差異不顯著。但在病菌感染方面，500 mg·L-1處理的種子染菌率最高，與0 mg·L-1GA3溶液處理的種子染菌率差異不顯著，與600 mg·L-1處理的種子染菌率差異顯著，與400 mg·L-1處理的種子染菌率差異極顯著，而600 mg·L-1GA3處理與其他濃度差異不顯著，因此600 mg·L-1為最適宜的GA3處理濃度。

由GA3溶液的3種浸泡時間的多重比較分析可知(表1)，浸泡48 h的種子發(fā)芽率最高，與浸泡24和72 h的種子發(fā)芽率差異顯著；而浸泡48 h的種子染菌率與72 h的種子染菌率差異顯著，與24 h的種子染菌率差異不顯著，因此，GA3最適宜浸泡時間為48 h。

由HgCl2不同滅菌時間的多重比較分析可以看出(表1)，滅菌20 min的種子發(fā)芽率最高，與10 min的種子發(fā)芽率差異不顯著，但滅菌20 min的種子染菌率低于10 min的種子染菌率，且差異顯著；雖然30 min滅菌效果最好，但發(fā)芽率最低，因此滅菌20 min為HgCl2最適宜滅菌時間。

2.2 培養(yǎng)基及激素對短瓣金蓮花不定芽增殖和生長的影響

由表2可知，16種不同的培養(yǎng)基類型和不同激素濃度組合對短瓣金蓮花的抽莖數(shù)和高增長影響差異顯著，組合3效果最好(圖1)，抽莖數(shù)最多，均值達(dá)到19.0，莖高增長為2.567 cm，且與其他組合差異顯著。

表1 GA3濃度、浸泡時間和HgCl2滅菌時間對短瓣金蓮花種子發(fā)芽率和染菌率的多重比較Table 1 Comparison on the seed germination and contamination rates of T.ledebouri among different GA3 soaking times, concentrations and sterilization times of HgCl2

圖1 金蓮花的增殖情況比較 (3)(4)(12)(8)為表2中培養(yǎng)基編號Fig.1 Comparison of the proliferation of T.ledebouri (3)(4)(12)(8)is No. of culture medium in Table.2

由3因素4水平正交設(shè)計對短瓣金蓮花增殖影響的方差分析和多重比較(圖2)可以看出，培養(yǎng)基類型和NAA濃度對短瓣金蓮花的抽莖數(shù)和莖高生長影響差異顯著， 6-BA濃度對短瓣金蓮花的抽莖數(shù)影響差異顯著，而對其莖高生長影響差異不顯著。4種培養(yǎng)基類型中，MS培養(yǎng)基對短瓣金蓮花抽莖數(shù)和莖高生長效果最好，且與其他3種培養(yǎng)基類型差異顯著，故MS為最適培養(yǎng)基類型。雖然6-BA對短瓣金蓮花的莖高生長的影響差異不顯著，但對短瓣金蓮花的抽莖數(shù)的影響差異顯著。6-BA 0.5和1.0 mg·L-1，都與0和1.5 mg·L-1差異顯著，而0.5與1.0 mg·L-1差異不顯著以用量少者為宜，故0.5 mg·L-1為6-BA的適宜濃度。NAA對短瓣金蓮花的抽莖數(shù)的影響， 0.05，0.10和0.15 mg·L-1差異不顯著，與0 mg·L-1差異顯著。而NAA對短瓣金蓮花的莖高生長的影響， 0.10，0和0.05 mg·L-1差異顯著，與0.15 mg·L-1差異不顯著；0.15與0.0 mg·L-1差異顯著，故0.10 mg·L-1為NAA的適宜濃度。因此短瓣金蓮花增殖的適宜培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

表2 不同培養(yǎng)基類型、不同濃度6-BA和NAA對短瓣金蓮花抽莖和生長的影響Table 2 Effects of Different culture medium, 6-BA and NAA on T.ledebouri seed stem growth

圖2 不同培養(yǎng)基類型、6-BA 和NAA對短瓣金蓮花抽莖和生長的影響Fig.2 Effects of different culture medium,6-BA and NAA on T.ledebouri seed stem growth

表3 不同培養(yǎng)基配比對金蓮花生根的影響Table 3 Effect of different medium proportion on T.ledebouri rooting

2.3 不同培養(yǎng)基及激素對短瓣金蓮花生根的影響

不同培養(yǎng)基類型及激素配比組合對短瓣金蓮花生根的影響差異顯著，1號組合無論是不定根數(shù)，還是最長根長度，還是莖高，與其他組合相比都差異顯著(表3)。從短瓣金蓮花根系發(fā)育來看，1號生根較好，長勢均勻且須根較多， 5號和6號組合不定根數(shù)量較多，但是根系短而粗，8號組合不定根數(shù)量較多但根系纖細(xì)，9號組合須根不夠發(fā)達(dá)，因此1號組合為最佳(圖3)。即MS不添加激素，培養(yǎng)效果最好。

圖3 金蓮花生根情況比較 (1)(8)(4)(7)為表3中培養(yǎng)基編號Fig.3 Comparison of rooting of T.ledebouri (1)(8)(4)(7)is No. of culture medium in Table.3

2.4 組培苗的煉苗與移栽

通過數(shù)量統(tǒng)計，其成活率高達(dá)90%以上(圖4)，符合植物組織組培快繁的要求。移出的組培苗要盡量保證陽光充足與通風(fēng)涼爽的環(huán)境，保持一定的濕度，之后逐漸降低濕度和增強光照，定期疏松培養(yǎng)土，保證其正常生長。

圖4 金蓮花移栽成活情況Fig.4 Survive of plantlets of T.ledebouri

3 討論

3.1 短瓣金蓮花種子的萌發(fā)特性

短瓣金蓮花與金蓮花屬其他種[3]一樣，其種子存在生理休眠現(xiàn)象，新采種子需經(jīng)低溫沙藏或赤霉素處理，才可萌發(fā)。本試驗證實了赤霉素打破休眠的作用，且GA3濃度增加能顯著促進(jìn)短瓣金蓮花種子的萌發(fā)，確定GA3的最適處理濃度為600 mg·L-1，且GA3浸泡時間為48 h萌發(fā)率最高。王玄[4]以金蓮花種子為材料，采用濃度范圍為50～350 mg·L-1的GA3，浸泡1～4 d，發(fā)現(xiàn)隨著GA3濃度增加，金蓮花種子達(dá)到最大萌發(fā)率相應(yīng)的處理時間有減少趨勢。胡海英[5]在金蓮花種子無菌播種實驗中用 100 mg·L-1GA3冷浸4天效果最佳。這說明對于金蓮花屬中不同種的種子催芽處理，采用GA3處理的濃度和處理時間不一樣。

3.2 種子消毒

短瓣金蓮花種子的除菌消毒較困難，延長滅菌時間，染菌率低，滅菌效果好，但同時對種子毒害也大。本實驗采用了0.1%的HgCl2滅菌，處理時間10～30 min，最后發(fā)現(xiàn)20 min滅菌效果最佳。這與楊玉芳[6]所提出的金蓮花種子滅菌方法一致，而鄭志新[7]研究提出的滅菌時間要短一些為10 min。

3.3 增殖培養(yǎng)

本實驗采用短瓣金蓮花無菌苗，以其根莖及以上部分的幼苗為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)基類型比較中，MS培養(yǎng)基與WPM相比，對短瓣金蓮花的高生長和抽莖數(shù)存在著極顯著性差異，而作為參照的WPM培養(yǎng)基并不適合短瓣金蓮花的生長。短瓣金蓮花的增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。楊玉芳[6]提出金蓮花增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是1/2MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，仍然為MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分減半，而添加激素的種類及濃度基本一致。鄭志新[7]又提出了金蓮花壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基(MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)和增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA 4.0 mg·L-1+2,4-D 0.2 mg·L-1)，激素濃度更大，這可能所用材料不同造成的。

3.4 生根培養(yǎng)

本次生根試驗的培養(yǎng)基配方采用正交設(shè)計的9種方案最終均能誘導(dǎo)短瓣金蓮花的外植體長出不定根，但各組不定的根的啟動時間和生長狀況存在著較大差異。其中1號試驗組的不定根啟動時間較早，生長狀況較好，根系均勻，數(shù)量及須根均較多，其配方為MS培養(yǎng)基，且不添加任何激素。楊玉芳[6]提出金蓮花生根培養(yǎng)基是1/2MS或1/2MS+0.05 mg·L-1NAA。對于較容易生根的材料，不需要添加激素，生根效果就很好，如馬藺[8]的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)中也不需要加入激素，就能獲得長勢良好的生根苗，這也從另一個側(cè)面證實了本研究結(jié)果的合理性。