張旭強(qiáng) 趙 敏 陳 璐 安炎黃 楊鵬軍 王新霞 楊 寧

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

植物的生長會受到環(huán)境非生物因素的極大影響，如干旱、高鹽、低溫等。植物要響應(yīng)并適應(yīng)這些脅迫條件從而在逆境中生存，在這些非生物脅迫中，干旱是限制植物生長和作物產(chǎn)量最嚴(yán)重的環(huán)境因子[1]。目前由于全球氣候變化致使氣溫不斷升高，加之中國水資源的分布不均衡，限制了作物的區(qū)域分布及生存，作物生長及產(chǎn)量等問題越來越受到社會各界專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。因此，闡明植物適應(yīng)和耐受干旱的生理和分子機(jī)理對提高農(nóng)作物的抗旱性、降低干旱對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的影響具有十分重要的意義。

植物遭受脅迫最重要的表現(xiàn)之一是細(xì)胞膜受到破壞，磷脂和糖脂等類脂構(gòu)成的雙分子層是細(xì)胞膜的基本骨架成分，其中磷脂對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用，其代謝產(chǎn)物調(diào)控許多重要的生理過程及細(xì)胞反應(yīng)。磷脂酶是催化磷脂降解的關(guān)鍵酶，其中PLD是植物組織中普遍存在的一類水解酶，它催化水解磷脂末端的磷酸二酯鍵，其水解產(chǎn)物為PA和親水性的膽堿等，例如：肌醇三磷酸(IP3)、乙酰膽堿等，它們在維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性及調(diào)節(jié)各種細(xì)胞信號傳導(dǎo)功能過程中起著至關(guān)重要的作用。PLD是一個多基因家族的酶，迄今包括水稻、楊樹和擬南芥在內(nèi)的至少8種植物的15種PLD已經(jīng)得到克隆[2]。姚騰[3]發(fā)現(xiàn)水稻的多數(shù)PLDs包括PLDα1、PLDα3、PLDδ2、PLDζ1、PLDζ2、PLDφ及PLDβ2均能被鹽脅迫所誘導(dǎo)，暗示水稻PLDs參與鹽脅迫響應(yīng)。王海燕[4]在楊樹中的研究結(jié)果表明，PLDα1和PLDδ3通過滲透調(diào)節(jié)機(jī)制、膜穩(wěn)定性機(jī)制以及其他的一些抗旱機(jī)制增強(qiáng)了84K楊樹的抗旱能力。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥存在12種不同的PLD基因，共分成6類：PLDα(3)，β(2)，γ(3)，δ，ε，ζ(2)，它們具有不同的生化、調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)特征[5～6]。近年來越來越多的研究將重點(diǎn)放在了PLD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能上，PLD及PA參與包括種子萌發(fā)、根毛生長、氣孔運(yùn)動、葉片衰老和果實成熟等植物的各個階段的生長發(fā)育過程[7～9]，越來越多的證據(jù)表明PLD和PA參與滲透脅迫[10～11]、低溫脅迫[12]和氧化脅迫[13]等多種非生物脅迫。NO是一種極其簡單的脂溶性氣體小分子物質(zhì)，容易透過細(xì)胞膜進(jìn)行擴(kuò)散，擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的功能[14]。在植物中，NO主要有NOS、NR、其它酶促反應(yīng)和非酶促等4種產(chǎn)生途徑。大量實驗證據(jù)表明NO是一種多功能的信號分子，在植物非生物脅迫的反應(yīng)中也起著關(guān)鍵的作用[15～16]。NO也參與了植物的種子的萌發(fā)，葉片衰老和開花生理等生長發(fā)育過程[17～19]。

PLDα1和PLDδ是擬南芥中含量最豐富的PLD，是內(nèi)源PA的主要來源之一[20～21]。目前，關(guān)于PLDα1在逆境下的研究較多，徐霽[22]的研究表明，PLDα1/PA可以誘導(dǎo)鹽脅迫下葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中NO的產(chǎn)生，而對干旱脅迫下PLDδ/PA和NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的研究則未見報道。因此我們選擇pldδ，noa1，nia1和nia2四種缺失型突變體和WT幼苗為材料，來研究PLDδ與NO在擬南芥耐旱性中的關(guān)系，旨在為PLD和NO在種子萌發(fā)中的關(guān)系研究及它們參與植物的抗旱機(jī)制提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

擬南芥種子分別為WT、pldδ(SALK_092469c)、noa1(CS6511)、nia1(CS6936)和nia2(CS2355)。其中WT和pldδ種子由本實驗室課題組提供，其余T-DNA插入突變體種子均購自美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心(ABRC)。

將擬南芥種子置于4℃冰箱中春化3 d，消毒后接種于MS培養(yǎng)基，在溫度22℃，光照2 000 lux，光周期為16/8 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 突變體鑒定

1.2.1 DNA提取

稱取擬南芥新鮮葉片0.2 g，按照EasyPure? Plant Genomic DNA Kit提取DNA。

1.2.2 引物設(shè)計

通過http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html網(wǎng)站查得，插入T-DNA片段的特異性通用引物序列LBa1：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表2 PCR體系Table 2 PCR system

1.2.3 PCR體系

PCR循環(huán)條件：Cycle1(1×)：94℃ 10 min；Cycle2(35×)：94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s；Cycle3(1×)：72℃ 10 min，以WT為對照進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表3 退火溫度及產(chǎn)物大小Table 3 Annealing temperature and product size

1.3 材料處理

經(jīng)前期實驗篩選，選擇100 μmol·L-1SNP作為外源NO供體濃度，選擇80 μmol·L-1PA作為外源PA供給濃度。以0.3 mol·L-1甘露醇模擬干旱脅迫，以WT和經(jīng)“三引物法”鑒定出的pldδ-2，noa1-3，nia1-2和nia2-5四個擬南芥純合突變體株系的T1代種子為材料，取生長15 d、長勢一致的幼苗進(jìn)行脅迫處理，處理時間為6、12、24、48和72 h，每個處理設(shè)置3個平行。

1.4 RNA提取和RT-qPCR檢測

1.4.1 總RNA提取

使用TaKaRa公司的Trizol試劑盒進(jìn)行總RNA提取，提取出的RNA用PrimerScriptTMRT reagent Kit With gCDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4.2 RT-qPCR反應(yīng)體系

RT-qPCR反應(yīng)程序為：Cycle 1(1×)：95℃ 10 min；Cycle 2(40×)：95℃ 15 s，60℃ 30 s；Cycle3(81×)：72℃ 30 s。

表4 引物序列Table 4 Primer sequences

表5 RT-qPCR反應(yīng)體系Table 5 RT-qPCR reaction system

1.5 PLD，NOS，NR活性及NO含量測定

PLD活性由上海酶聯(lián)生物公司的試劑盒測定，NOS，NR活性及NO含量由南京建成生物公司提供的試劑盒測定，詳細(xì)操作見說明書。

1.6 種子萌發(fā)率測定

每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)有50顆種子，從開始光照培養(yǎng)時起，以露白作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)每日統(tǒng)計萌發(fā)的種子數(shù)目，以萌發(fā)數(shù)目不再增加為止。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗3次獨(dú)立重復(fù)，數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用最小顯著差異法(Duncan)分析不同數(shù)據(jù)組間的差異性，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。作圖使用Origin9.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 noa1，nia1和nia2純合突變體鑒定

通過“三引物法”鑒定篩選T-DNA插入純合突變體(圖1)，WT基因特異性引物(FP+RP)均可以擴(kuò)增出對應(yīng)的目的條帶，noa1-3，nia1-2和nia2-5三個突變體株系用基因特異性引物(FP+RP)無法擴(kuò)增出條帶，而用T-DNA特異性引物L(fēng)Ba1和RP可以擴(kuò)增出目的條帶，說明三種突變體株系均為T-DNA插入純合突變體，以純合株系的T1代種子為材料進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 干旱脅迫對PLD活性和NO含量的影響

不同濃度甘露醇均導(dǎo)致PLD活性發(fā)生顯著變化(圖2)，其中PLD活性在0.3 mol·L-1甘露醇處理下除24 h低于其他濃度外，其他脅迫時間PLD活性均顯著高于其他濃度的甘露醇處理，并隨脅迫時間表現(xiàn)為前期降低，后期升高的變化趨勢，因此后續(xù)的實驗采用0.3 mol·L-1甘露醇來模擬干旱脅迫。干旱脅迫使得WT幼苗NO含量增加(圖3)，表現(xiàn)為隨脅迫處理時間逐漸上升的趨勢，并在72 h達(dá)到最大。

圖1 noa1，nia1和nia2純合突變體的篩選 A～C分別表示noa1-3，nia1-2和nia2-5純合突變體鑒定結(jié)果；1.WT(FP+RP)；2.突變體(FP+RP)；3.突變體(LB+RP)Fig.1 Identification of noa1,nia1 and nia2 homozygous mutants A-C show the results of identification of noa1-3,nia1-2 and nia2-5 homozygous mutants; 1.WT(FP+RP); 2.Mutants(FP+RP); 3.Mutants(LB+RP)

圖2 干旱脅迫對PLD活性的影響 小寫字母表示同一時間不同處理組在P≤0.05時的顯著性差異，下同。Fig.2 Effects of PLD activity on drought stress Lowercase letters in the figure indicate the significant differences among the different treatment groups at the same time P≤0.05, the same as below.

圖3 干旱脅迫對NO含量的影響 大寫字母表示不同時間相同處理組在P≤0.05時的顯著性差異，下同。Fig.3 Effects of NO content on drought stress Capital letters indicate significant differences among the same treatment groups at different times P≤0.05,the same as below.

2.3 干旱脅迫對NOS和NR活性的影響

干旱脅迫下WT幼苗NOS活性除24 h降低外，其他時間段均較對照組顯著升高(圖4A)，在脅迫后期達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定。干旱導(dǎo)致NR活性顯著升高(圖4B)，并隨脅迫時間整體表現(xiàn)為上升趨勢，在72 h時NR活性達(dá)到最大，其中NR活性相較于NOS活性變化更為顯著。

圖4 干旱脅迫對NOS和NR活性的影響Fig.4 Effects of NOS and NR activity on drought stress

2.4 干旱脅迫下NOS和NR缺失對NO含量的影響

為了研究干旱脅迫下NO的主要產(chǎn)生途徑，我們檢測了noa1，nia1和nia2幼苗NO含量(圖5)，無論干旱還是未干旱處理noa1，nia1和nia2均顯著低于WT幼苗NO含量，其中以nia2幼苗NO含量最低，表明干旱脅迫下內(nèi)源NO生成過程中NR2相較于NR1和NOS可能發(fā)揮更為重要的作用。

圖5 干旱脅迫對noa1，nia1和nia2幼苗NO含量的影響Fig.5 Effects of noa1,nia1 and nia2 seedling NO concent on drought stress

2.5 干旱脅迫對PLDδ、NOA1、NIA1和NIA2基因相對表達(dá)量的影響

為了研究干旱脅迫下PLD，NOS和NR活性變化的原因，我們檢測了PLDδ，NOA1，NIA1和NIA2的基因表達(dá)量的變化情況。PLDδ基因相對表達(dá)量(圖6A)除12 h降低外其他處理時間均顯著增加，并表現(xiàn)為脅迫前期迅速降低后期有所升高的變化趨勢，與PLD活性在0.3 mol·L-1甘露醇脅迫下的變化趨勢相似(圖2)。NOA1相對表達(dá)量(圖6B)在脅迫前期迅速升高，脅迫后期下降。干旱脅迫下NIA1和NIA2(圖6:C～D)基因相對表達(dá)量升高，并均表現(xiàn)為隨脅迫時間的延長而持續(xù)升高的變化趨勢，其中NIA2基因表達(dá)量變化更為顯著。

圖6 干旱脅迫對PLDδ，NOA1，NIA1和NIA2基因相對表達(dá)量的影響Fig.6 Relative expression of PLDδ,NOA1,NIA1 and NIA2 on drought stress

2.6 干旱脅迫對pldδ和nia2種子萌發(fā)的影響

由于NR活性及NIA2基因相對表達(dá)量在干旱脅迫下上升更加明顯，所以我們選擇了pldδ和nia2兩種突變體來研究PLDδ和NO在種子萌發(fā)中的關(guān)系。圖7A為干旱處理10 d的種子萌發(fā)情況，干旱脅迫抑制了pldδ和nia2的種子萌發(fā)，處理3 d即與WT有顯著差異，隨后萌發(fā)數(shù)緩慢增加，但差異一直存在，最終pldδ和nia2的種子萌發(fā)率低于WT，且nia2的種子萌發(fā)抑制較pldδ更為明顯。100 μmol·L-1SNP可以促進(jìn)干旱脅迫下WT，pldδ和nia2的種子萌發(fā)，且SNP對nia2的促進(jìn)效果更為顯著(圖7B)；80 μmol·L-1PA可以顯著促進(jìn)干旱脅迫下WT和pldδ的種子萌發(fā)，但不能促進(jìn)nia2的種子萌發(fā)。干旱脅迫下外源補(bǔ)充的NO和PA并不能使pldδ和nia2的萌發(fā)率恢復(fù)到WT的水平。圖8為萌發(fā)20 d后WT，pldδ和nia2幼苗的生長狀況，未干旱處理的對照組(CK)中pldδ，nia2與WT在葉片顏色，大小以及植株大小上均無明顯差異，而干旱脅迫對pldδ和nia2幼苗的影響比WT幼苗更加明顯，pldδ和nia2幼苗較WT均表現(xiàn)為生長緩慢，種子萌發(fā)率和成活率顯著降低。外施PA顯著促進(jìn)了干旱脅迫下WT和pldδ的種子萌發(fā)率和成活率，但PA對nia2無明顯促進(jìn)作用，外施SNP均顯著促進(jìn)WT、pldδ和nia2的種子萌發(fā)率和成活率。

2.7 干旱脅迫下外源SNP和PA處理對內(nèi)源NO含量的影響

為了研究干旱脅迫下pldδ和nia2的萌發(fā)抑制是否與內(nèi)源NO含量變化有關(guān)，我們檢測了干旱脅迫下外源SNP和PA對nia2和pldδ中NO產(chǎn)生的影響作為補(bǔ)償實驗。正常和干旱脅迫下pldδ和nia2的內(nèi)源NO含量均顯著低于WT(圖9)。SNP均可促進(jìn)干旱脅迫下pldδ和nia2中NO產(chǎn)生，而PA可以促進(jìn)干旱脅迫下pldδ中NO的含量，但不能促進(jìn)nia2中NO的產(chǎn)生。

圖7 干旱脅迫對pldδ和nia2種子萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of drought stress on germination of pldδ and nia2 seeds

圖8 干旱脅迫對WT，pldδ和nia2種子生長的影響Fig.8 Effect of drought stress on growth of WT,pldδ and nia2 seeds

圖9 外源SNP和PA對干旱脅迫下pldδ和nia2中NO含量的影響Fig.9 Effects of exogenous SNP and PA on NO contents of pldδ and nia2 under drought stress

3 討論

3.1 PLDδ和NO參與干旱脅迫下擬南芥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

細(xì)胞膜是植物感受外界環(huán)境刺激最初的部位，而PLD是一類重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶類[23]。低溫脅迫下對PLDδ的研究較多[24]，而對干旱脅迫下PLDδ的作用研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)0.3 mol·L-1甘露醇處理下PLD活性變化最為顯著，PLD活性除24 h低于對照組外，其他時間均顯著升高(圖2)，干旱脅迫下PLDδ基因相對表達(dá)量發(fā)生顯著變化，除12 h降低外其他時間段均顯著升高(圖6A)，推測PLD活性在24 h的降低與PLDδ基因表達(dá)降低有關(guān)，PLDδ基因表達(dá)與PLD活性均隨脅迫時間表現(xiàn)為先降低而后上升的趨勢，說明PLD活性變化與PLDδ的基因表達(dá)呈正相關(guān)，且基因表達(dá)先于酶活變化。

大量研究結(jié)果表明，NO能夠通過調(diào)節(jié)植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累[25]、氣孔運(yùn)動[26]光合作用和抗氧化酶活性[27]等生理過程來緩解干旱脅迫造成的不良影響，以此來增強(qiáng)植物對干旱的耐受性。植物體內(nèi)NO來源非常豐富，主要通過NOS和NR途徑產(chǎn)生[28]，但系統(tǒng)的研究干旱脅迫下NO主要產(chǎn)生途徑的實驗依據(jù)較少。本研究發(fā)現(xiàn)NO含量，NOS和NR活性在干旱脅迫下均顯著變化(圖3～4)，其中NR活性增加比NOS活性更為顯著；通過檢測NO三種突變體中NO含量變化情況(圖5)，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下三種突變體幼苗NO含量均較WT顯著降低，其中nia2中NO含量最少，以上結(jié)果表明NOS途徑和NR途徑均參與干旱脅迫下NO的產(chǎn)生，且NR途徑對NO產(chǎn)生的貢獻(xiàn)更大，這與Xuan[29]和Lozano-Juste J[30]等的研究結(jié)果相似。為了研究NOS和NR活性變化的原因，我們研究了與NOS和NR相關(guān)的基因NOA1，NIA1和NIA2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NOA1基因表達(dá)量(圖6B)在前期上調(diào)而在后期下調(diào)，這與NOS活性變化并沒有表現(xiàn)出相同趨勢，有研究表明，NOA1基因是目前唯一在植物中報道的以L-精氨酸(L-Arg)為原料參與NO合成的酶的基因[31]，根據(jù)本實驗結(jié)果我們推測，由NOA1基因調(diào)控的NOS途徑可能主要參與了干旱脅迫早期NO的生成，說明植物中還存在依賴L-Arg的其它基因參與NOS誘導(dǎo)的NO合成途徑。Yu等[32]發(fā)現(xiàn)擬南芥NR1和NR2有著相似的氨基酸序列，但也有完全不同的區(qū)域，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氮同化過程中起著不同的作用，本研究中NIA1和NIA2基因表達(dá)量均隨脅迫時間逐漸上調(diào)(圖6:C～D)，這與NR活性具有相同變化趨勢，表明干旱脅迫下NR活性的上升與NIA1和NIA2兩個基因表達(dá)呈正相關(guān)，其中NIA2的表達(dá)量顯著高于NIA1，說明NR活性的升高主要與NIA2基因表達(dá)有關(guān)，NR2途徑是干旱脅迫下NO的主要產(chǎn)生途徑。

3.2 PLDδ，NIA2缺失影響干旱脅迫下擬南芥的種子萌發(fā)

在實驗中我們發(fā)現(xiàn)pldδ和nia2兩種突變體對干旱脅迫更為敏感，干旱顯著抑制了pldδ和nia2的種子萌發(fā)，且對nia2的萌發(fā)抑制效果更為顯著(圖7A，圖8)，推測NR2和PLDδ這兩個酶在干旱脅迫下的種子萌發(fā)過程中發(fā)揮了重要作用，NR2在這一過程中可能起著更重要的作用。糊粉層被認(rèn)為是種子休眠的決定因素，擬南芥糊粉層細(xì)胞能夠產(chǎn)生NO，誘導(dǎo)儲存蛋白的液泡化，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)[33]。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)0.1和0.5 mmol·L-1的SNP明顯促進(jìn)滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)，胚根和胚芽的伸長，提高萌發(fā)過程中淀粉酶和內(nèi)肽酶的活力，加速貯藏物質(zhì)的降解，同時還能促進(jìn)滲透脅迫下的過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸酶(APX)活性的上升和脯氨酸酶含量的積累，抑制脂氧合酶(LOX)的活性，從而提高滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)過程中的抗氧化能力。Zhang[35]等在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)PLD/PA參與NO傳遞鹽信號過程，暗示PLD和NO之間存在某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系。NR2和PLDδ缺失最直接的效應(yīng)便是下游產(chǎn)物的減少，因此我們添加NO供體SNP以及PLDδ產(chǎn)物PA進(jìn)行補(bǔ)償實驗(圖7B)，發(fā)現(xiàn)SNP和PA處理均可以不同程度的逆轉(zhuǎn)干旱脅迫對WT種子萌發(fā)的抑制，SNP可以緩解干旱脅迫對nia2萌發(fā)的抑制，而PA處理則沒有效果，說明干旱脅迫下PA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于NR2；PA和SNP處理均可促進(jìn)干旱脅迫下pldδ的種子萌發(fā)，推測干旱脅迫下NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不依賴于PLDδ；PA和SNP對pldδ和nia2中NO含量的影響也得到了相似的結(jié)果，SNP能促進(jìn)WT，pldδ和nia2中NO的產(chǎn)生，PA能促進(jìn)WT和pldδ中NO的生成，但不能促進(jìn)nia2中NO的產(chǎn)生(圖9)，表明PLDδ/PA可通過NR2途徑產(chǎn)生的NO參與干旱脅迫下的種子萌發(fā)過程，PLDδ位于NO信號的上游。干旱脅迫下pldδ和nia2補(bǔ)償PA和NO后種子萌發(fā)并不能恢復(fù)到與WT相同的水平，說明NR2和PLDδ還通過其他途徑影響干旱脅迫下的種子萌發(fā)過程。

綜上所述，PLD和NO能積極響應(yīng)干旱脅迫，PLD活性變化與PLDδ基因的表達(dá)呈正相關(guān)；由NR2途徑產(chǎn)生的NO是干旱脅迫下NO的主要生成途徑，其活性的上升與NIA2基因表達(dá)呈正相關(guān)；由NOA1基因調(diào)控的NOS途徑主要參與了干旱脅迫早期NO的生成；干旱脅迫下PLDδ/PA位于NO信號的上游，且PLDδ的產(chǎn)物PA主要通過NR2途徑產(chǎn)生的NO促進(jìn)擬南芥的種子萌發(fā)。本研究將細(xì)胞膜重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶PLD與氣體信號分子NO聯(lián)系起來，揭示了干旱脅迫下擬南芥種子萌發(fā)中PLDδ及NO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，為PLD和NO的信號研究提供了新的思路，但PA本身作為一種第二信使，具有復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且與靶蛋白有著很多的結(jié)合及激活方式[36]，本研究中PA與NR2具體的結(jié)合或激活方式還需要進(jìn)一步深入的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方面的實驗來驗證。