序列特異性引物聯(lián)合RT-PCR在LRRK2基因多態(tài)性分型中的應(yīng)用

葛 彪 田改生 李勤學(xué) 李馮銳

(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院老年病科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

帕金森病(PD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其患病率隨年齡增長有增高趨勢。LRRK2基因包含51個外顯子，編碼產(chǎn)物為2 527個氨基酸組成的蛋白，具有GTP酶與蛋白激酶活性，并發(fā)現(xiàn)與PD發(fā)病相關(guān)的路易體形成關(guān)系密切。LRRK2在家族性和散發(fā)性PD的發(fā)病中起一定作用，目前已證實該基因約有20多個疾病相關(guān)性位點，其中R1628P、G2385R位點突變在包括中國、新加坡、日本和中國臺灣等東亞各國家和地區(qū)的散發(fā)性PD患者中高發(fā)〔1,2〕。而對LRRK2基因功能及突變與PD相關(guān)性的研究逐漸成為熱點。本研究將RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于LRRK2基因R1628P與G2385R位點的基因型分型，期望建立一種方便、快捷、高通量的檢測平臺，為PD的基礎(chǔ)研究與臨床診斷提供新方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑 SYBR?Prime EX TaqTM Real time PCR試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白酶K購自Sigma公司；其余分析純試劑均購自 Amresco公司；PCR引物委托上海生工生物工程公司合成。

1.2樣品來源及DNA提取 中國北方地區(qū)漢族人群散發(fā)性PD患者100例，均由神經(jīng)內(nèi)科學(xué)專家依據(jù)英國腦庫PD診斷標準進行診斷。本研究得到倫理委員會批準，均簽署知情同意書。受試對象抽取靜脈血1 ml，枸櫞酸鈉抗凝。4℃離心15 min，收集白細胞，采用常規(guī)SDS-蛋白酶K/酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.3已知基因型的DNA標準品 本實驗室已經(jīng)在先期研究中驗證的LRRK2基因R1628P、G2385R位點基因型的白細胞基因組DNA樣品。其中包括R1628P位點2種基因型，GG型、GC型各5例；G2385R位點3種基因型，GG型、GA型、AA型各5例。

1.4LRRK2基因R1628P、G2385R基因型檢驗 將SYBR Green Reanl time PCR作為技術(shù)平臺，采用相對定量的方法，以人β2-微球蛋白(B2M)作為內(nèi)參基因，輔以序列特異引物引導(dǎo)的PCR反應(yīng)(PCR-SSP)，設(shè)定標準品中雜合子對應(yīng)的野生堿基作為對照組，對LRRK2基因R1628P、G2385R位點基因多態(tài)性分型檢驗，引物序列見表1?；蚍中徒Y(jié)果：R1628P位點，引物U1對應(yīng)野生堿基G，引物U2對應(yīng)突變堿基C；G2385R位點，引物L(fēng)1對應(yīng)野生堿基G；引物L(fēng)2對應(yīng)突變堿基A。PCR反應(yīng)體系總體積20 μl，含dd H2O 6.0 μl、SYBR?Prime Ex TaqTM (2×)10 μl、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl、ROX 熒光染料Ⅱ(50×)0.4 μl、基因組DNA(10 ng/μl)2.0 μl。PCR反應(yīng)在實時定量PCR擴增儀(ABI 7500)上進行。兩步法PCR擴增標準程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環(huán)40次。每個待檢測樣品均設(shè)3個復(fù)孔，每次PCR反應(yīng)均設(shè)陽性對照與陰性對照。

表1 擴增引物序列信息

2 結(jié) 果

2.1對標準品的基因型檢驗 標準品純合子的相對表達量是雜合子的2倍。LRRK2-R1628P位點檢測其基因型可見G/G純合子及G/C雜合子；LRRK2-G2385R位點檢測其基因型可見G/G及A/A純合子、G/A雜合子。本實驗所得基因型分型結(jié)果與已知基因型完全吻合。

2.2對待測樣品的基因型檢驗 對標準品實現(xiàn)成功分型后，采用相同方法對待測樣品進行檢驗，并用經(jīng)典的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)的方法驗證分型結(jié)果的準確性，我們發(fā)現(xiàn)兩種分型方法所獲得的基因型分型結(jié)果完全一致。由此可見，本研究建立的LRRK2基因多態(tài)性分型方法同樣可以實現(xiàn)準確的基因型分型。本次調(diào)查的100例PD樣品中未見R1628P位點變異后形成的C/C雜合子。

3 討 論

RT-PCR技術(shù)通過熒光信號的積累監(jiān)測整個反應(yīng)進程，使PCR擴增和終產(chǎn)物檢測全部處在封閉的條件下，從而具有實時監(jiān)測、檢測范圍寬、敏感性高、特異性好的突出優(yōu)勢，該方法無后續(xù)的檢測步驟，有效避免了交叉污染，方便快速，同時可以進行多重檢測，節(jié)省大量試驗時間和成本，極大地克服了傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的不足。本研究針對目的基因的特定位點，設(shè)計序列特異性引物，優(yōu)化包括引物量和模板量在內(nèi)的反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)，成功建立了可檢測LRRK2基因R1628P、G2385R位點的SYBR Green Real time PCR技術(shù)平臺，可應(yīng)用于PD相關(guān)基因LRRK2疾病易感位點的基礎(chǔ)研究與臨床診斷。本研究采用的SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA微槽(MGB)的染料，結(jié)合后熒光強度增加100倍。熒光信號隨PCR進程與不斷生成的產(chǎn)物呈正比，形成熒光擴增曲線，熒光強度的增加與初始模板相關(guān)，可進行靶核酸的定量檢測。因此，研究中發(fā)現(xiàn)純合子的起始拷貝量相當(dāng)于雜合子的2倍，在序列特異性引物的引導(dǎo)下實現(xiàn)了基因型的準確分型。該方法與高度敏感及特異的Taqman探針相比，使用SYBR Green進行熒光定量引物設(shè)計較簡單，成本相對較低，同樣可以達到實驗?zāi)康?，適合在基層研究機構(gòu)的高通量檢測。