劉春朋，付 晶*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225）

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，除了營(yíng)養(yǎng)、遺傳因素之外，環(huán)境也是一個(gè)重要的因素。動(dòng)物在飼養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常遭受各種環(huán)境應(yīng)激源的影響，如溫度應(yīng)激（冷、熱）、光照應(yīng)激、有害氣體應(yīng)激（硫化氫、氨氣）、粉塵應(yīng)激以及運(yùn)輸應(yīng)激等，其中溫度應(yīng)激比較普遍[1]。如果這些應(yīng)激得不到及時(shí)治理，將會(huì)直接影響到畜禽的健康以及畜產(chǎn)品品質(zhì)，進(jìn)而危害人類(lèi)健康。寒冷是北方地區(qū)畜牧生產(chǎn)所面臨的普遍應(yīng)激源。冷應(yīng)激可引起畜禽尤其是幼畜或新生仔畜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、免疫機(jī)能下降、腹瀉、生產(chǎn)性能下降甚至死亡[2]。鵪鶉是一種高產(chǎn)高效的特禽，其生物學(xué)特性比較特殊，鵪鶉在飼養(yǎng)過(guò)程中對(duì)環(huán)境溫度的要求是相對(duì)較高的，尤其是育雛期的溫度比雞還要高，因此更容易受到冷應(yīng)激的影響[3]。

胸腺是禽類(lèi)免疫系統(tǒng)中重要的淋巴器官，其參與細(xì)胞免疫的過(guò)程，是T細(xì)胞分化、發(fā)育、產(chǎn)生的場(chǎng)所，在整個(gè)免疫系統(tǒng)中起著中樞作用，其損傷必將導(dǎo)致免疫功能障礙進(jìn)而引發(fā)一系列疾病。有研究表明，當(dāng)雞受到熱應(yīng)激后，免疫器官有明顯損傷，尤其是胸腺組織會(huì)發(fā)生萎縮性變化，機(jī)體免疫功能下降[4]。而目前關(guān)于冷應(yīng)激對(duì)雛鵪鶉胸腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響研究較少。因此，本試驗(yàn)以1日齡雛鵪鶉為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)雛鵪鶉胸腺組織病理組織學(xué)觀察，探討冷應(yīng)激導(dǎo)致禽類(lèi)免疫功能下降的作用機(jī)制，以期為更好地研究鵪鶉內(nèi)環(huán)境打下基礎(chǔ)，也為探索促進(jìn)禽類(lèi)冷適應(yīng)的方法、提高禽類(lèi)的抗寒能力提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡健康沙維瑪特肉用公鵪鶉360只，購(gòu)自哈爾濱萬(wàn)家特禽養(yǎng)殖合作社。

1.2 主要試劑

磷酸戊二醛、乙醇、丙酮、四氧化鋨等常規(guī)試劑均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 主要儀器

Phenix/鳳凰電子顯微鏡（型號(hào)為PH100-DB500 U-IPL），購(gòu)自鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司；日立高新透射電鏡（型號(hào)為HT7700），購(gòu)自天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 冷應(yīng)激模型的建立

2.1.1 急性冷應(yīng)激

試驗(yàn)將1日齡沙威瑪特肉用鵪鶉180只飼養(yǎng)至15日齡，隨機(jī)分為6組，每組30只。對(duì)照組冷應(yīng)激0 h（即放在鵪鶉正常育雛期所需溫度34±1℃的舍內(nèi)飼養(yǎng)），其余5組分別進(jìn)行冷應(yīng)激處理，即把鵪鶉置于（12±1）℃的舍內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)時(shí)間分別為0.5、1、3、6和12 h。在各時(shí)間隨機(jī)選取10只進(jìn)行剖殺，并采集胸腺組織。

2.1.2 慢性冷應(yīng)激

試驗(yàn)將1日齡沙威瑪特肉用鵪鶉180只飼養(yǎng)至15日齡，隨機(jī)分為6組，每組30只。前3組為對(duì)照組，即正常溫度下分別飼養(yǎng)5、10和20 d后剖殺；其余3組為應(yīng)激組，分別于（12±1）℃冷應(yīng)激環(huán)境下飼養(yǎng)5、10和20 d后剖殺取樣。

整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，各組雛鵪鶉均自由飲水和采食，并按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

2.2 胸腺組織超微結(jié)構(gòu)的觀察

鵪鶉剖殺時(shí)迅速在每只鵪鶉中采集3份1 mm3大小的胸腺組織樣品，并固定于濃度為2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液（pH為7.2）中＞4 h。然后根據(jù)廖望的試驗(yàn)方法，將固定好的樣品用PBS漂洗3次，15 min·次-1；之后使用2%鋨酸固定2 h，再用PBS漂洗3次，再依次進(jìn)行脫水、置換、浸透、包埋、聚合、切片、染色等過(guò)程[5]。最后在透射電鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 急性冷應(yīng)激時(shí)胸腺組織超微結(jié)構(gòu)的變化

急性冷應(yīng)激時(shí)胸腺組織的超微結(jié)構(gòu)變化見(jiàn)圖1。

圖1 急性冷應(yīng)激時(shí)胸腺組織的超微結(jié)構(gòu)變化

急性冷應(yīng)激時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，排列緊密，細(xì)胞核成卵圓形，清晰可見(jiàn)，線粒體嵴排列整齊，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)腫脹肥大現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體形態(tài)規(guī)則，無(wú)擴(kuò)張（見(jiàn)圖1A）；急性冷應(yīng)激0.5 h時(shí)，線粒體出現(xiàn)輕微的嵴斷裂，核仁大多瓦解消失（見(jiàn)圖1B）；急性冷應(yīng)激1h時(shí)，線粒體出現(xiàn)較嚴(yán)重的空泡化，細(xì)胞間隙增寬（見(jiàn)圖1C）；急性冷應(yīng)激3 h時(shí)，細(xì)胞核輕微變形，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間隙增大（見(jiàn)圖1D）；急性冷應(yīng)激6 h時(shí)，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象（見(jiàn)圖1E）；急性冷應(yīng)激12 h時(shí)，細(xì)胞核破裂，變大或者消失，發(fā)生細(xì)胞凋亡（見(jiàn)圖1F）。

3.2 慢性冷應(yīng)激時(shí)法氏囊組織超微結(jié)構(gòu)的變化

慢性冷應(yīng)激時(shí)胸腺組織的超微結(jié)構(gòu)變化見(jiàn)圖2。慢性冷應(yīng)激時(shí)，5 d的對(duì)照組胸腺組織超微結(jié)構(gòu)顯示為：細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，排列緊密，細(xì)胞核成卵圓形，清晰可見(jiàn)，線粒體嵴排列整齊，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)清晰（見(jiàn)圖2A）；冷應(yīng)激5 d時(shí)，嵴數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)增，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有包被受損線粒體的趨勢(shì)（見(jiàn)圖2B）；冷應(yīng)激10 d時(shí)，細(xì)胞排列松散，細(xì)胞核輕微變形染色質(zhì)結(jié)塊，部分邊聚，并出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包被線粒體（見(jiàn)圖2C，2D）；冷應(yīng)激20 d時(shí)，線粒體空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，染色質(zhì)結(jié)塊，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和自噬溶酶體（見(jiàn)圖2E，2F）。

圖2 慢性冷應(yīng)激時(shí)胸腺組織的超微結(jié)構(gòu)變化

4 討論

胸腺參與機(jī)體的細(xì)胞免疫，胸腺的發(fā)育狀態(tài)和機(jī)能的強(qiáng)弱將直接影響著自身免疫水平。應(yīng)激可以導(dǎo)致畜禽機(jī)體免疫機(jī)能下降、生產(chǎn)性能下降、誘發(fā)疾病甚至死亡[6]。研究結(jié)果表明，冷應(yīng)激引起的機(jī)體免疫力下降涉及體液免疫、細(xì)胞免疫以及腸道黏膜免疫[7-9]。由于研究者所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在種屬差異且應(yīng)激的強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間也不相同。因此，目前關(guān)于冷應(yīng)激對(duì)畜禽免疫損傷的機(jī)制并不十分清楚。細(xì)胞凋亡是由多基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，是程序性細(xì)胞壞死的主要形式[10]。關(guān)于熱應(yīng)激能夠?qū)е滦笄菝庖咂鞴侔l(fā)生形態(tài)學(xué)損傷和細(xì)胞凋亡的研究已有報(bào)道。唐嘉等研究表明，在熱應(yīng)激下對(duì)雞的胸腺體積、胸腺小葉、皮髓質(zhì)等進(jìn)行觀察得出胸腺與對(duì)照組相比體積、胸腺小葉的數(shù)量、胸腺小體的個(gè)數(shù)、皮髓質(zhì)的比例均減小，出現(xiàn)胸腺萎縮，而這種萎縮與細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]。此外，熱應(yīng)激下雞胸腺組織遭受到較大損害，出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化現(xiàn)象，濾泡間隙增大，結(jié)締組織出現(xiàn)增生[12]。

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)雛鵪鶉胸腺組織超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激能夠?qū)е滦叵俳M織細(xì)胞器受損，發(fā)生細(xì)胞凋亡，且隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，慢性冷應(yīng)激的凋亡程度重于急性冷應(yīng)激，這與前人的研究結(jié)果基本一致。這可能是冷應(yīng)激造成機(jī)體免疫損傷的一個(gè)途徑。在以后的研究中，可以從細(xì)胞凋亡通路進(jìn)一步探討冷應(yīng)激致雛鵪鶉免疫器官損傷的機(jī)制。