李 萌，李 雪，鄭志強(qiáng)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000）

實(shí)時(shí)熒光定量簡稱PCR。該技術(shù)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)得到的更加快速、靈敏、特異的核算定量技術(shù)，有著光譜高敏感性以及定量精確等特點(diǎn)，可以對(duì)PCR中熒光信號(hào)變化進(jìn)行直接探測，從而得到定量結(jié)果。為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)該技術(shù)研究及應(yīng)用，本文將針對(duì)其原理、特點(diǎn)及應(yīng)用前景進(jìn)行探討。

1 原理

Ct是熒光定量PCR技術(shù)中重要的一個(gè)值，代表著每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)在達(dá)到設(shè)定閾值過程中所需要經(jīng)歷循環(huán)數(shù)。在進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)中需要加入特定波長的熒光染料或者基團(tuán)，然后通過儀器對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測，得到其積累信號(hào)即為PCR反應(yīng)進(jìn)程，從而定量定性分析起始模板。PCR反應(yīng)產(chǎn)物隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行而不斷積累，同時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)不斷呈正比增加。熒光強(qiáng)度信號(hào)隨著每個(gè)循環(huán)的完成而不斷收集，從而通過熒光強(qiáng)度變化對(duì)產(chǎn)物量的變化進(jìn)行監(jiān)測，進(jìn)而將結(jié)果繪制成擴(kuò)增曲線圖。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法

SYBR Green I檢測。SYBR Green I是一種燃料，具有綠色激發(fā)波長，能夠和dsDNA小溝部位相結(jié)合，不過期綠色激發(fā)波長只有在和dsDNA結(jié)合后方可發(fā)光。變性過程中DNA的雙鏈分開，此時(shí)熒光不會(huì)發(fā)生；復(fù)性和延伸過程中會(huì)形成dsDNA此時(shí)SYBR Green I會(huì)與之結(jié)合并有綠色熒光出現(xiàn)。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量可以根據(jù)熒光強(qiáng)度反應(yīng)出來。

TaqMan探針。常規(guī)TaqMan探針的5'端對(duì)熒光發(fā)射基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素）進(jìn)行標(biāo)記，3'端對(duì)熒光淬滅基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）進(jìn)行標(biāo)記。在PCR過程中，該探針無法實(shí)現(xiàn)延伸。按照FRET原理可知，如果保持完整的探針那么5'端發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射會(huì)受到3'端淬滅基團(tuán)的抑制作用。探針和模板在PCR的退火期會(huì)出現(xiàn)特異性雜交，在Taq酶作用下延伸期引物會(huì)沿DNA模板不斷延伸直到抵達(dá)探針處，此時(shí)Taq酶的5'-3'外切活性會(huì)發(fā)揮出來，從而置換過程初選。在將探針切斷后，會(huì)導(dǎo)致FAM和TAMRA出現(xiàn)分離同時(shí)將釋放熒光信號(hào)。此時(shí)光密度會(huì)增加，通過熒光探測系統(tǒng)能夠檢測到這一現(xiàn)象。每復(fù)制一次模板就會(huì)切斷一個(gè)探針，并且釋放一個(gè)熒光信號(hào)。

分子信標(biāo)。Taq Man探針衍生了分子信標(biāo)（Molecular beacons）。分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)為發(fā)夾形狀，主要是單鏈DNA形成，兩段分別標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，熒光報(bào)告基團(tuán)會(huì)在發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成時(shí)靠近淬滅基團(tuán)，發(fā)生FRET，構(gòu)象會(huì)在熱循環(huán)溫度達(dá)到分子信標(biāo)解鏈溫度時(shí)出現(xiàn)改變，可以結(jié)合模板形成線性分子，線性分子具有延展性，能夠促使FRET消失，同時(shí)熒光信號(hào)由報(bào)告基團(tuán)發(fā)出。

復(fù)合探針。復(fù)合探針法是將Light Cycler和分子信標(biāo)兩種技術(shù)的優(yōu)勢充分結(jié)合應(yīng)用，首先將熒光探針和淬滅探針結(jié)合，兩探針分別包含5'端接熒光分子和3'端接淬滅分子，兩者可以實(shí)現(xiàn)雜交。兩種探針如果在沒有模板的溶液中仍可以特異結(jié)合，淬滅探針會(huì)吸收熒光探針發(fā)出的熒光，此時(shí)熒光并不會(huì)產(chǎn)生在容易當(dāng)中；兩者在有模板的溶液中且溫度較高情況下可以結(jié)合模板，從而分離兩探針，此時(shí)有熒光產(chǎn)生。溶液中模板數(shù)量越多，熒光強(qiáng)度會(huì)越大，所以能夠根據(jù)熒光強(qiáng)度定量分析PCR。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法

3.1 絕對(duì)定量法

用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣本的量進(jìn)行推算的方法為絕對(duì)定量法。此種方法需要明確標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度情況，然后稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品，分為幾個(gè)不同梯度濃度然后進(jìn)行反應(yīng)測試。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為測得的Ct值，進(jìn)而繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)，在定量分析未知樣品過程中根據(jù)其Ct值能夠?qū)悠鹗伎截悢?shù)推算出。

3.2 相對(duì)定量法

比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)定量法。在一定樣本中，靶序列相對(duì)于另一參照樣本量變化情況進(jìn)行分析的方法為相對(duì)定量法。在采用該方法過程中，需要有參照物，所以較容易繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度確定便可進(jìn)行對(duì)比分析。

比較Ct值的相對(duì)定量法。此方法是將待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段同時(shí)擴(kuò)增，可以在兩個(gè)反應(yīng)管中或者一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并且就兩者的Ct值之差即ΔCt進(jìn)行測量。在采用此方法過程中需要用數(shù)學(xué)公式進(jìn)行相對(duì)量的計(jì)算，首先要假設(shè)每個(gè)循環(huán)產(chǎn)物增加一倍時(shí)PCR反應(yīng)指數(shù)期得到Ct值對(duì)起始模板的量一個(gè)循環(huán)的估算和起始模板數(shù)兩倍相當(dāng)。這種方法的前提是靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致，所以在應(yīng)用過程中效率的偏移會(huì)對(duì)實(shí)際拷貝數(shù)估計(jì)產(chǎn)生一定影響，因此，為了保證目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，這也是該方法應(yīng)用的難點(diǎn)之一。

4 應(yīng) 用

4.1 在獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

病原體的分子檢測。PCR技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)病原體的DNA或者RNA序列進(jìn)行定性分析，能夠盡早觀察整個(gè)病程中病原體的情況，由于其特性，該技術(shù)在疾病早期診斷、藥物治療效果、病情判斷以及診斷遺傳病過程中發(fā)揮了重要作用。有相關(guān)研究者利用TaqMan MGB探針方法對(duì)牛流行熱病毒進(jìn)行檢測，利用該技術(shù)定量分析10～100個(gè)病毒基因組分子的范圍的病毒RNA。

環(huán)境監(jiān)測。微生物含量是否超標(biāo)是當(dāng)前水資源、居家辦公環(huán)境質(zhì)量報(bào)告中一項(xiàng)重要指標(biāo)，如果沒有及時(shí)有效監(jiān)測微生物含量，這些物質(zhì)可能威脅人體的身心健康。和傳統(tǒng)方法相比，實(shí)時(shí)定量熒光PCR能夠縮短環(huán)境監(jiān)測時(shí)間，且有著較高的靈敏度。

4.2 在腫瘤方面的應(yīng)用

有研究學(xué)者在1998年利用RQ-PCR重排了4例前B細(xì)胞ALL中TCR，發(fā)現(xiàn)其敏感性類似于斑點(diǎn)雜交，但是比液相雜交低。還有研究者在2004年結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原（CEA）mRNA的表達(dá)量中利用PCR技術(shù)進(jìn)行了測定，測量結(jié)果可以用于癌癥轉(zhuǎn)移的測定。

5 展 望

當(dāng)前在生物學(xué)及其他領(lǐng)域已經(jīng)充分利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)有著敏感性高、測量快速等特點(diǎn)。隨著信息科技的不斷發(fā)展，該技術(shù)也在不斷進(jìn)步，成為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的一項(xiàng)重要方法。