陸 上， 畢穎敏， 楊 洋， 胡付品， 楊 帆

由于抗菌藥物的廣泛和不合理使用，細(xì)菌耐藥問題日益突出。多重耐藥革蘭陰性菌如碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）的出現(xiàn)，使現(xiàn)有多數(shù)抗菌藥物失去效力。與此同時(shí)，新型抗菌藥物的研發(fā)卻相對(duì)滯后，在此困境下，發(fā)現(xiàn)于1947年，后由于腎毒性和神經(jīng)毒性被臨床棄用多年的多黏菌素，憑借其對(duì)需氧革蘭陰性菌的良好抗菌活性被重新應(yīng)用于臨床，并成為治療廣泛耐藥革蘭陰性菌感染的重要選擇[1-2]。

然而，隨著多黏菌素臨床應(yīng)用的增加，不可避免地出現(xiàn)對(duì)其耐藥的菌株。過去認(rèn)為多黏菌素耐藥都由染色體相關(guān)基因的突變引起，如phoP/phoQ，pmrA/pmrB，crrA/crrB等雙組份調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的突變或其負(fù)反饋調(diào)控基因mgrB的滅活等[3]；2015年，中國(guó)學(xué)者Liu等[4]首次發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶多黏菌素基因mcr-1，通過編碼MCR-1，一種磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，催化磷酸乙醇胺與細(xì)菌外膜脂多糖的結(jié)合，介導(dǎo)多黏菌素耐藥。隨后mcr-1基因在意大利、南非、美國(guó)等多個(gè)國(guó)家被報(bào)道，見于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌等不同菌屬中[5]。質(zhì)粒介導(dǎo)mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)，表明多黏菌素耐藥基因可在不同菌屬中水平傳播，提示多黏菌素耐藥威脅上升。

為了解國(guó)內(nèi)臨床mcr-1基因的流行情況，本研究對(duì)臨床分離腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行了mcr-1基因的篩查，并對(duì)mcr-1陽(yáng)性菌株進(jìn)行藥敏分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2015—2016年來(lái)自全國(guó)13個(gè)城市不同醫(yī)院的臨床分離腸桿菌科細(xì)菌共計(jì)1 617株，各醫(yī)院按統(tǒng)一操作規(guī)程將菌株鑒定到種，并記錄菌株的相關(guān)標(biāo)本信息，置甘油肉湯管中-80 ℃冰箱保存。剔除同一患者相同部位的重復(fù)分離菌株。藥敏試驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，本院抗生素研究所保存菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物 抗菌藥物包括多黏菌素E、美羅培南、頭孢噻肟等16種抗菌藥物，為中國(guó)藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品。藥敏試驗(yàn)所用陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯（CAMHB）為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；LB瓊脂，LB肉湯為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；rTaq酶、蛋白酶K、Xba I限制性內(nèi)切酶等相關(guān)試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；低熔點(diǎn)瓊脂糖（Incert）和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）電泳級(jí)瓊脂糖（SeaKem Gold Agarose）購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判定 微量肉湯稀釋法測(cè)定9株mcr-1陽(yáng)性菌株對(duì)16種抗菌藥物的敏感性，操作步驟和結(jié)果判讀參考2017年版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[6]。多黏菌素E藥敏結(jié)果根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，MIC≤2 mg/L為敏感，MIC＞2 mg/L為耐藥[7]；替加環(huán)素藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）標(biāo)準(zhǔn)判讀，MIC≤2 mg/L為敏感，MIC＞8 mg/ L為耐藥；頭孢哌酮-舒巴坦藥敏結(jié)果按照CLSI頭孢哌酮的折點(diǎn)判讀，MIC≤16 mg/L為敏感，MIC≥64 mg/L為耐藥[8]；藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件分析。

1.2.2mcr-1基因檢測(cè) 煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，具體步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]；PCR方法檢測(cè)mcr-1基因，所用引物按文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[4]， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST程序比對(duì)分析證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物基因的正確性。

1.2.3mcr-1陽(yáng)性菌株P(guān)FGE分析 參照美國(guó)CDC PulseNet中用于大腸埃希菌的PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行操作，選用沙門菌H9812作為標(biāo)準(zhǔn)菌。在細(xì)胞懸浮液CSB中加入過夜培養(yǎng)細(xì)菌，調(diào)整菌液濃度至4.0～4.5麥?zhǔn)蠁挝?，?00 μL至1.5 mL離心管中，再加入適量蛋白K和1% Seakem Gold凝膠，凝固后加入裂解液和蛋白酶K裂解，隨后用水和TE buffer重復(fù)洗滌。膠塊經(jīng)Xba I進(jìn)行酶切后電泳、染色成像。圖像轉(zhuǎn)換后應(yīng)用BioNumeric數(shù)據(jù)庫(kù)軟件處理，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA 進(jìn)行聚類分析[10-11]。

2 結(jié)果

2.1 腸桿菌科細(xì)菌mcr-1陽(yáng)性菌株檢測(cè)

1 617株臨床分離腸桿菌科細(xì)菌，包括肺炎克雷伯菌（682/1 617，42.2%）、大腸埃希菌（625/1 617，38.7%）、腸桿菌屬（99/1 617，6.1%，其中陰溝腸桿菌68株，產(chǎn)氣腸桿菌31株）、變形桿菌屬（96/1 617，5.9%，其中奇異變形桿菌72株、普通變形桿菌24株）、黏質(zhì)沙雷菌（48/1 617， 3.0%）、枸櫞酸桿菌屬（34/1 617，2.1%，其中弗氏枸櫞酸桿菌33株，布氏枸櫞酸桿菌1株）、摩根摩根菌（24/1 617，1.5%）和普羅威登菌（9/1 617， 0.6%）。PCR檢測(cè)及DNA測(cè)序結(jié)果顯示，1 617株臨床分離腸桿菌科細(xì)菌中，僅9株（0.6%）細(xì)菌mcr-1基因檢測(cè)呈陽(yáng)性，9株中1株為肺炎克雷伯菌，8株為大腸埃希菌，其他菌屬未檢測(cè)到mcr-1基因。

2.2 mcr-1陽(yáng)性菌株對(duì)常見抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示，9株mcr-1陽(yáng)性菌株對(duì)多黏菌素E均耐藥，多黏菌素E的MIC為4～8 mg/L；全部菌株對(duì)頭孢美唑、碳青霉烯類藥物及替加環(huán)素均敏感；除1株大腸埃希菌外，其余菌株對(duì)第三、第四代頭孢菌素和氨曲南均耐藥。8株大腸埃希菌對(duì)哌拉西林-他唑巴坦均敏感； 9株細(xì)菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均耐藥，其中15-W25-21、16-W16-15、16-W16-81同時(shí)對(duì)阿米卡星耐藥，MIC均＞128 mg/L；環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)9株細(xì)菌的MIC分別為＞8 mg/L和＞ 16 mg/L，見表1。

表1 mcr-1陽(yáng)性菌株對(duì)常用抗菌藥物的MIC及其臨床資料Table 1 The minimum inhibitory concentrations of antimicrobial agents against mcr-1 positive strains and the corresponding clinical data

2.3 mcr-1陽(yáng)性菌株的標(biāo)本來(lái)源及PFGE分析

9株mcr-1陽(yáng)性菌株先后于2015年10－12月和2016年5－12月分離獲取，標(biāo)本來(lái)源包括血液、痰、引流液和傷口滲出液，見表1；對(duì)其中8株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌的PFGE分析顯示，8株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌Xba I酶切PFGE，條帶數(shù)目在14～20，條帶分子量25 kb～600 kb， Dice-UPGMA聚類分析8株細(xì)菌分屬8個(gè)不同型別，未出現(xiàn)同源性高于80%的菌株，見圖1。

圖1 8株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌的標(biāo)本來(lái)源及PFGE聚類分析Figure 1 Pulsed- fi eld gel electrophoresis-based clustering analysis of 8 mcr-1 positive Escherichia coli strains

3 討論

在過去的數(shù)十年間，盡管多黏菌素因腎毒性和神經(jīng)毒性一度被臨床棄用，但是在畜牧業(yè)，長(zhǎng)期以來(lái)各國(guó)一直將多黏菌素E用于畜禽的促生長(zhǎng)或疾病的預(yù)防和治療，其中，中國(guó)更是獸用多黏菌素E的最大生產(chǎn)國(guó)，亞洲各國(guó)（包括中國(guó)在內(nèi)）在多黏菌素E的全球生產(chǎn)中所占的比例為73.1%，其中28.7%出口至歐洲[12]。2015年， 歐盟和北美分別進(jìn)口了480噸和700噸來(lái)自中國(guó)的多黏菌素E[12]。全球范圍內(nèi)多黏菌素E的大量使用，給動(dòng)物及環(huán)境中的細(xì)菌造成強(qiáng)大的選擇壓力，加速了多黏菌素耐藥菌株的選擇，促進(jìn)了mcr-1的播散。目前，mcr-1基因已在美國(guó)、意大利、丹麥、尼日利亞、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、突尼斯、加拿大等全球35個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道，在動(dòng)物性食品、水、蔬菜、臨床分離樣本和健康人群體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，且已擴(kuò)散到多種腸桿菌科細(xì)菌中，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、沙門菌屬等[13]。其中，mcr-1在動(dòng)物源性菌株中的檢測(cè)率較高，在臨床菌株及健康人類中檢測(cè)率維持在較低水平，表明mcr-1基因已經(jīng)廣泛存在于環(huán)境中并可能通過某種途徑由動(dòng)物傳播給人類[5，14]。

質(zhì)粒介導(dǎo)mcr-1的出現(xiàn)，引發(fā)了對(duì)于多黏菌素耐藥的高度關(guān)注和憂慮。本研究篩查了來(lái)自全國(guó)多個(gè)省份和地區(qū)共1 617株臨床分離腸桿菌科細(xì)菌，僅9株（0.6%）細(xì)菌mcr-1基因檢測(cè)呈陽(yáng)性，其中682株肺炎克雷伯菌中僅1株mcr-1陽(yáng)性，625株大腸埃希菌中8株（1.3%）mcr-1陽(yáng)性，其他菌屬中并未檢測(cè)到mcr-1基因，表明臨床分離腸桿菌科細(xì)菌中mcr-1的檢出率仍比較低，推測(cè)這可能與前數(shù)十年我國(guó)臨床使用該類藥物較少有關(guān)。本研究檢測(cè)出的9株mcr-1陽(yáng)性菌株多黏菌素MIC值僅4～8 mg/L，其他作者報(bào)道多黏菌素對(duì)mcr-1陽(yáng)性菌株的MIC值基本上介于2～16 mg/L，處于較低水平[15-16]，同時(shí)，藥敏結(jié)果顯示，8株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌中，除菌株16-W57-09外，其他細(xì)菌對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟均高度耐藥，但對(duì)頭孢美唑及哌拉西林-他唑巴坦卻均高度敏感，大多數(shù)菌株同時(shí)也對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦顯示敏感，高度提示這7株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌為AmpC酶陰性但同時(shí)攜帶有ESBL基因的多重耐藥菌株。進(jìn)一步藥敏分析發(fā)現(xiàn)，盡管mcr-1陽(yáng)性菌株對(duì)頭孢菌素、氨曲南、喹諾酮類藥物及慶大霉素敏感性差，但對(duì)頭孢美唑、碳青霉烯類藥物、替加環(huán)素均敏感，8株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌對(duì)哌拉西林-他唑巴坦也大多敏感。因此，質(zhì)粒攜帶mcr-1基因介導(dǎo)的多黏菌素耐藥相比染色體介導(dǎo)耐藥而言，在目前分離臨床菌株更為少見，耐藥水平相對(duì)較低，仍有多種抗菌藥物可供選擇，目前造成的威脅可能不如后者。

8株mcr-1陽(yáng)性大腸埃希菌來(lái)源于不同的省市，且分屬8個(gè)不同的PFGE型別，提示其間并無(wú)mcr-1陽(yáng)性菌株的克隆傳播。但既往研究表明，mcr-1存在于多種類型的質(zhì)粒上如IncI2、IncHI2、IncX4等[17]，這些質(zhì)粒常常攜帶多種耐藥基因如β 內(nèi)酰胺酶基因（blaCTX-M、blaSHV-2、blaCMY-2等）、磷霉素耐藥基因fosA3和喹諾酮耐藥基因oqxAB等[18-19]，并可通過結(jié)合轉(zhuǎn)移至多種臨床常見的宿主細(xì)菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌等，威脅耐藥革蘭陰性菌的治療[4]。因此在我國(guó)多黏菌素恢復(fù)供應(yīng)、使用日益增長(zhǎng)情況下，攜帶mcr-1和其他藥物耐藥基因的質(zhì)?？稍谄溥x擇壓力下發(fā)生水平傳播，導(dǎo)致對(duì)β內(nèi)酰胺類、多黏菌素、磷霉素、氟喹諾酮類等重要抗菌藥物多重耐藥的威脅亦隨之增長(zhǎng)，因此，應(yīng)對(duì)mcr-1基因在臨床分離菌的檢出情況和攜帶該基因菌株的藥敏進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)和密切關(guān)注。