• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      丹蛭降糖膠囊治療肥胖引起的慢性腎病的機(jī)制研究

      2018-07-27 08:20:54胡冰峰方朝暉魯云霞
      關(guān)鍵詞:勻漿高脂高脂血癥

      吳 斌,張 一,陳 勇,劉 權(quán),李 瑞,胡冰峰,方朝暉,魯云霞

      (1.安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室,安徽 合肥 230032;2.安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院,安徽 池州 247099;3.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽 合肥 230022;4.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)專業(yè)2014級(jí),安徽 合肥 230032;5. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽 合肥 230031)

      慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)是各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙,其中肥胖是CKD進(jìn)展的漸進(jìn)性獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子,但影響的具體途徑尚不確切[1]。最近臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,肥胖引起的CKD腎中由脂類的異位沉積、脂類代謝失調(diào)和氧化應(yīng)激組成的應(yīng)激信號(hào)網(wǎng)絡(luò)共同參與CKD的發(fā)生、發(fā)展[2]。

      丹蛭降糖膠囊(Danzhi Jiangtang Capsule,DJC)是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,由太子參、生地黃、菟絲子、牡丹皮、水蛭等藥組成,具有益氣、養(yǎng)陰、活血之功效,對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)癥有確切的療效[3]。DJC改善糖尿病大鼠腎功能的機(jī)制可能是通過(guò)抗氧化,從而抑制 JAK2/STAT3炎癥信號(hào)通路的活化,降低腎臟局部炎癥因子的表達(dá)[4]。DJC也可通過(guò)下調(diào)肥胖大鼠骨骼肌細(xì)胞CD36 的表達(dá),減輕骨骼肌脂質(zhì)沉積,來(lái)改善骨骼肌胰島素抵抗[4]。但目前關(guān)于DJC是否可作為調(diào)血脂藥物,改善脂代謝紊亂和腎損傷及其機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,因此,本文探討DJC保護(hù)高脂血癥大鼠腎損傷的作用機(jī)制,為該藥用于臨床治療肥胖引起的CKD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1材料

      1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠,♂,8周齡,體質(zhì)量180~200 g,購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(皖)2006-001,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

      1.1.2藥物與試劑 DJC購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥房;RNAiso Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TaqTM購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗磷酸化腺苷酸活化的蛋白激酶α(phospho-AMP-activated protein kinase α,p-AMPKα)和AMPKα單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗過(guò)氧化物酶體增殖劑活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)、PPARγ多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司;兔抗CD36多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;鼠抗β-actin、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司;甘油三酯(triglyceride,TG)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,TSOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、總一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase,TNOS)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。所有引物均采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì),由上海生工生物工程有限公司合成。

      1.1.3儀器 Olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀;日本Nikon 80i熒光正置顯微鏡;英國(guó)Teche PCR儀;北京六一儀器廠電泳儀、電轉(zhuǎn)儀;Gel Documentation system曝光系統(tǒng)和Chemi Scope series凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自Clinx科學(xué)儀器有限公司。

      1.2方法

      1.2.1動(dòng)物分組與處理 將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON,n=10),高脂飲食組(HFD,n=40)。CON組喂基礎(chǔ)飼料,HFD組喂自制的高脂飲食(由55%基礎(chǔ)飼料、12%豬油、5%蔗糖、8%奶粉、5%花生、10%雞蛋、3%芝麻油、2%食鹽組成)。12周后,取體質(zhì)量明顯增加的大鼠30只,隨機(jī)分為HFD組、高脂飲食+低劑量DJC治療組(HFD+DJCL) 和高脂飲食+高劑量DJC治療組(HFD+DJCH),每組10只。HFD組繼續(xù)給予高脂飲食8周, HFD+DJCL和HFD+DJCH組在給予高脂飲食的同時(shí),分別給予DJC 500、1 000 mg·kg-1·d-1干預(yù)8周,CON和HFD組分別灌胃等體積的蒸餾水。所有操作均遵守安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

      1.2.2血清代謝指標(biāo)分析 所有大鼠禁食12 h后稱重,水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血分離血清(3 000 r·min-1,15 min),分析血清TG、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿酸(uric acid,UA)、肌酐(serum creatinine,Scr)水平。

      1.2.3腎勻漿TG和氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 稱取腎組織,冰水浴條件下,用勻漿器制備成10%的組織勻漿,4℃、3 000 r·min-1離心10 min,取上清。MDA、TSOD、CuZn-SOD、CAT、GSH-Px、TNOS測(cè)定均按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。稱取組織后,按100 g·L-1加入無(wú)水乙醇,勻漿器勻漿,4℃放置1 h,4℃、4 000 r·min-1離心15 min,取上清液進(jìn)行TG的測(cè)定。

      1.2.4腎臟的HE、油紅O和PAS染色 將大鼠腎臟用4%的多聚甲醛溶液固定72 h,石蠟包埋,3 μm切片后行HE染色,并拍照。將-80℃凍存的腎臟取出制備冰凍切片,4%的多聚甲醛溶液固定30 min,1,2-丙二醇室溫孵育2 min,油紅O工作液染色60 min,蘇木精染液復(fù)染后,甘油明膠封片。PAS染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,將切片用95%的乙醇固定10 min,10 g·L-1過(guò)碘酸液作用20 min,Schiff染液中染色60 min,蘇木精染液復(fù)染10 min后拍照。

      1.2.5腎臟免疫組化分析 石蠟包埋腎組織以4 μm連續(xù)切片,SABC法進(jìn)行CD36的免疫組化分析, DAB顯色,脫水、透明和封片,光鏡下觀察并拍照,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,棕黃色顆粒區(qū)為陽(yáng)性信號(hào),并用生物圖像軟件計(jì)算各組免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(integral optical density, IOD )。

      1.2.6RT-PCR RNAiso Plus提取各組大鼠腎組織的RNA,按照RT試劑盒說(shuō)明書(shū)操作得到cDNA后,常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳后,凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析灰度值。RNA的相對(duì)表達(dá)水平以目的基因灰度值與內(nèi)參GAPDH的比值表示。檢測(cè)的目的基因及引物序列見(jiàn)Tab 1。

      Tab 1 Primer sequences for target genes

      1.2.7Western blot法檢測(cè)腎組織中蛋白的表達(dá) RIPA裂解液提取各組腎組織的蛋白質(zhì)后,BCA法測(cè)定其濃度,10% SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜,分別以β-actin(1 ∶400)、phospho-AMPKα(1 ∶1 000)、AMPK(1 ∶1 000)、PPARα(1 ∶800)、PPARγ(1 ∶800)孵育過(guò)夜,二抗(1 ∶10 000)孵育2 h,TBST漂洗,電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色成像,凝膠分析軟件計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)含量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      2 結(jié)果

      2.1DJC對(duì)高脂飲食大鼠體質(zhì)量及血清脂代謝、腎功能的影響與CON組相比,HFD組大鼠血清TG、TC、BUN、UA、Scr濃度均升高,HDL-C濃度下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與HFD組相比,HFD+DJCL、HFD+DJCH組的血清TG、TC、UA、Scr水平均降低,HDL-C水平上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),有一定的劑量效應(yīng)。4組大鼠之間體質(zhì)量的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2)。

      2.2DJC對(duì)高脂血癥大鼠腎勻漿TG和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響如Fig 1所示,與CON組相比,HFD組大鼠腎勻漿TG明顯升高(P<0.01),而與HFD組相比,DJC 2個(gè)劑量組均可明顯降低腎勻漿的TG含量(P<0.05)。與CON組相比,HFD組腎勻漿CAT、TNOS、TSOD、CuZn-SOD水平明顯降低,GSH-Px、MDA水平明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);DJC 組腎勻漿CAT、TNOS、TSOD、Cu Zn-SOD水平上升,GSH-Px、MDA水平明顯降低,以HFD+DJCH組最為明顯,并有一定的劑量效應(yīng)(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)Tab 3。

      Fig 1 Effect of DJC on triglyceride levels in kidney

      ##P<0.01vsCON group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

      2.3DJC對(duì)高脂血癥大鼠腎臟病理學(xué)的影響HE結(jié)果顯示,與CON組對(duì)比,HFD 組大鼠腎臟的腎小球體積明顯增大,系膜細(xì)胞增殖,腎小囊腔變大;DJC 治療后腎臟的上述病變明顯減輕,以HFD+DJCH組更為明顯(Fig 2)。油紅O結(jié)果顯示,與CON組對(duì)比,HFD 組大鼠的腎小球和腎小管脂質(zhì)沉積明顯增多;DJC 治療后腎小管的脂質(zhì)沉積明顯減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。PAS染色結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD 組大鼠的腎小球系膜基質(zhì)中有大量糖原沉積,而DJC 治療組大鼠的腎小球系膜基質(zhì)中的糖原含量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),以HFD+DJCH組病變程度更輕,有一定的劑量效應(yīng)(Fig 3)。

      Tab 2 Effect of DJC treatment on serum lipid and kidney metabolism

      #P<0.05,##P<0.01vsCON group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

      Tab 3 Effect of DJC on oxidative stress indices in n=10)

      #P<0.05vsCON group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

      Fig 2 Effect of DJC on pathological changes in kidneyinduced by HFD(HE staining,×400)

      2.4DJC對(duì)高脂血癥大鼠腎臟CD36表達(dá)和定位的影響CD36主要分布在胞膜和胞質(zhì)的核內(nèi)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體[6]。與CON組對(duì)比,HFD 組大鼠腎臟CD36的表達(dá)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);DJC 治療組腎臟CD36的表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且隨著劑量的增大,CD36的表達(dá)進(jìn)一步降低(Fig 4)。

      2.5DJC對(duì)高脂血癥大鼠腎臟脂合成基因mRNA表達(dá)的影響與CON組對(duì)比,HFD組腎臟組織中SREBP1c、FASN基因的mRNA水平表達(dá)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),HFD+DJC組的SREBP1c、FASN基因表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),見(jiàn)Fig 5。

      2.6DJC對(duì)高脂血癥大鼠腎臟AMPK、PPARα、PPARγ蛋白表達(dá)的影響與CON組對(duì)比,HFD組腎臟組織中的p-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)明顯減少,PPARγ的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);與HFD組相比,HFD+DJC組腎臟組織p-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)明顯升高,PPARγ的蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),且有一定的劑量效應(yīng)(Fig 6)。

      Fig 3 Effect of DJC on pathological changes in kidney induced by HFD(×400)

      Fig 4 Effect of DJC on expression and distribution of FAT/CD36 in kidney by immunohistochemistry(×400)

      Fig 5 Effect of DJC on mRNA expression of SREBP1cand FASN in kidney by RT-PCR

      ##P<0.01vsCON group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

      3 討論

      中心性肥胖和脂代謝紊亂、高尿酸血癥可引起并加重腎臟損害。在本研究中,我們應(yīng)用SD大鼠高脂血癥模型評(píng)價(jià)了DJC的降脂活性,并探討了其基于AMPK信號(hào)通路的降脂作用機(jī)制。HFD組大鼠表現(xiàn)為高脂血癥和高尿酸、肌酐、尿素氮血癥,腎臟內(nèi)有明顯的脂質(zhì)沉積;DJC治療后,血脂、尿酸、肌酐、尿素氮和腎內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯降低,提示其具有改善血脂、腎功能和腎內(nèi)脂質(zhì)異位沉積的作用,并有一定的劑量效應(yīng)。

      Fig 6 Effect of DJC on expression of p-AMPK/AMPK,PPARα and PPARγ in kidney by Western blot

      #P<0.05,##P<0.01vsCON group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

      脂質(zhì)在腎臟內(nèi)沉積,可通過(guò)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生MDA和各種自由基,引起氧化應(yīng)激?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,DJC組方中太子參、牡丹皮能升高SOD活性,降低MDA水平,減少氧化應(yīng)激[7-8];地黃被廣泛地用于滋陰養(yǎng)腎,其中的活性成分梓醇能降低糖尿病大鼠的血漿TC、TG水平,升高HDL-C水平,同時(shí)通過(guò)升高胰腺中SOD、GSH-Px、CAT水平,減少M(fèi)DA水平來(lái)減少氧化應(yīng)激[9]。因此,推測(cè)復(fù)方制劑DJC可能也有減少氧化應(yīng)激的作用。本研究證實(shí)了DJC能通過(guò)增加腎臟中CAT、TSOD的表達(dá)以及激活TNOS、降低MDA水平來(lái)發(fā)揮抗氧化作用,并有一定的劑量效應(yīng)。Sun等[10]的研究也證實(shí),在糖尿病腎病模型中,DJC有抗氧化作用,與本研究的結(jié)果一致。DJC中與抗氧化作用相關(guān)的單體成分還有待進(jìn)一步的分離鑒定。

      CD36是介導(dǎo)長(zhǎng)鏈脂肪酸、氧化型脂質(zhì)等的結(jié)合和攝取的多功能受體。腎臟 CD36主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞、足細(xì)胞和系膜細(xì)胞中,高脂血癥、高血糖和CKD患者中CD36的表達(dá)明顯上調(diào),在小鼠中阻止CD36的表達(dá)可防止CKD的進(jìn)展,提示其在腎損傷中的重要作用,成為CKD的潛在治療靶標(biāo)[11]。本研究結(jié)果表明,高脂飲食確實(shí)引起了CD36在腎組織中的表達(dá)升高,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致,而不同劑量的DJC治療均可減少CD36的表達(dá),且有一定的劑量效應(yīng),提示DJC治療CKD的作用可能與其調(diào)節(jié)CD36的表達(dá)有關(guān)。

      AMPK是一種重要的細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器,與肥胖、高脂血癥、糖尿病等多種由能量代謝異常引起的疾病相關(guān)[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道,AMPK的激活抑制了肝SREBP1c的功能,從而抑制了肝臟脂肪的生成[13]。我們的研究則表明DJC可能通過(guò)激活高脂血癥大鼠腎組織中AMPK,增加下游脂肪分解基因PPARα的表達(dá),減少下游PPARγ、SREBP1c、FASN基因的表達(dá),來(lái)減少腎臟脂質(zhì)的沉積和減輕體重,改善腎組織內(nèi)的脂代謝紊亂。

      綜上所述,DJC能有效降低高脂血癥大鼠的血脂、腎臟TG和緩解腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激水平,并能明顯改善大鼠的腎功能。機(jī)制研究表明,DJC能通過(guò)激活A(yù)MPK,進(jìn)而活化下游脂肪分解基因PPARα的表達(dá),抑制CD36和脂肪生成基因PPARγ、SREBP1c、FASN的表達(dá),并有一定的劑量效應(yīng),這為DJC在CKD的臨床治療應(yīng)用上提供了新的證據(jù)支持。

      (致謝:本實(shí)驗(yàn)在安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室和綜合實(shí)驗(yàn)室完成,感謝實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)們給予的幫助和指導(dǎo)!)

      猜你喜歡
      勻漿高脂高脂血癥
      高脂血標(biāo)本對(duì)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目的干擾及消除對(duì)策
      勻漿法提取沙棗果總黃酮工藝研究
      植物研究(2018年4期)2018-07-24 00:52:26
      不同誘導(dǎo)方式制備的大鼠肝勻漿代謝酶活性及凍儲(chǔ)方式的比較
      運(yùn)動(dòng)降低MG53表達(dá)及其在緩解高脂膳食大鼠IR中的作用
      高脂血癥對(duì)生化檢驗(yàn)項(xiàng)目的干擾及消除
      食物不耐受與高脂血癥的關(guān)系
      高脂飲食誘導(dǎo)大鼠生精功能障礙
      社區(qū)健康促進(jìn)模式降低老年高脂血癥的效果
      前列安丸對(duì)瓊脂所致慢性前列腺炎模型大鼠前列腺勻漿中IgG和血清Zn的影響
      味精與高脂日糧對(duì)生長(zhǎng)豬胴體性狀與組成的影響
      蓬溪县| 永济市| 卫辉市| 尼木县| 元氏县| 莱芜市| 崇明县| 凉城县| 安义县| 郓城县| 双柏县| 太白县| 亚东县| 林周县| 金华市| 天镇县| 泊头市| 五大连池市| 龙口市| 珲春市| 林西县| 新平| 临邑县| 通许县| 双峰县| 大悟县| 会同县| 龙口市| 巫山县| 苏州市| 谢通门县| 商都县| 芜湖市| 建水县| 蚌埠市| 西充县| 绥中县| 华池县| 建宁县| 潼南县| 台北县|