張 鳳，韓利文，張 云，韓 建，侯海榮，王希敏，劉可春，田青平，何秋霞

[1. 山西醫(yī)科大學藥學院，山西 太原 030001；2. 齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選重點實驗室，山東 濟南 250014]

氯氮平是一種非典型抗精神病藥物，對于精神分裂癥患者具有明顯的療效，并且減少了導致錐體外系運動障礙的傾向。自1961年上市以來，因為副作用，氯氮平一直飽受爭議。氯氮平毒性機制研究的結(jié)論不一致。最初報道的副作用是粒細胞缺乏癥，最近幾年集中在心臟毒性。氯氮平引起的心臟毒性報道最多的是心肌炎[1]，擴張型心肌病和心包炎也有報道。嚴重的心臟副作用不僅影響了氯氮平對患者的治療效果，還限制了其廣泛應用。臨床數(shù)據(jù)顯示，受感染患者的心內(nèi)膜心肌活檢標本中可以觀察到嗜酸性粒細胞和嗜酸性包涵體。因此，很多研究認為，IgE介導的超敏反應是氯氮平心臟毒性的原因。此外，Elman等[2]發(fā)現(xiàn)，相比其他抗精神病藥物，氯氮平治療患者血漿的去甲腎上腺素水平升高，這可致左心室功能障礙。其他可能的氯氮平心臟毒性機制包括細胞色素P450 1A2、1A3酶缺乏，鈣依賴性離子通道的阻斷，以及低硒水平[3]。探索其心臟毒性發(fā)生的機制既有利于解釋氯氮平產(chǎn)生心肌炎、心包炎的原因，又可為進一步尋找保護心臟損傷的藥物提供參考。

斑馬魚是近年來廣受關(guān)注的整體模式生物，其基因組編碼序列與人類基因組的同源性為87%左右。斑馬魚的生物學結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動物高度相似，具有繁殖能力強、體積小、成本低、發(fā)育周期短、胚胎透明、體外發(fā)育等特點，廣泛應用于藥物活性篩選[4]、模型構(gòu)建和毒理學[5]評價中。發(fā)育早期的斑馬魚胚胎透明，研究人員可以清晰地觀察到斑馬魚的心跳以及血液循環(huán)，直觀評估其心率、收縮性、節(jié)律性和形態(tài)變化[6]。因此，本研究采用斑馬魚作為模式生物，旨在揭示氯氮平心臟毒性的反應和發(fā)生機制，為氯氮平臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器氯氮平(批號076M4128V)、吖啶橙(acridine orange，AO，批號A6014)均購自Sigma-Aldrich公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司；SYBR? Green PCR Master Mix熒光定量PCR反應試劑盒購自Vazyme公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。HPG-280BX型光照培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設備(北京愛生科技公司)；奧林巴斯SZX16型熒光體視顯微鏡、IX51奧林巴斯倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；LightCycler? 96型實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2實驗動物野生型AB系斑馬魚，由山東省科學院生物研究所藥物篩選重點實驗室提供，養(yǎng)殖和繁殖方法參照相關(guān)文獻[7]。將斑馬魚放在水溫為28℃的魚缸中飼養(yǎng)，光照周期為14 h光照和10 h黑暗。成魚的食物為鹵蟲的無節(jié)幼體，每天喂食兩次。日常飼養(yǎng)過程中，♀♂斑馬魚分開喂養(yǎng)，在需要收集胚胎時將♀♂斑馬魚按照1 ∶2 或1 ∶1的比例放入交配缸中。于次日早上抽去隔板，利用光照刺激交配反射，抽去隔板1～2 h后，收集受精卵，并用胚胎培養(yǎng)水(5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.14 mmol·L-1CaCl2、0.16 mmol·L-1MgSO4)清洗3遍，除去斑馬魚排泄物和死卵，健康胚胎放入28.5℃恒溫光照培養(yǎng)箱(HPG-280BX型)中繼續(xù)孵育，在受精24 h后于顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎，備用。

1.3方法

1.3.1氯氮平的急性毒性檢測 將發(fā)育正常的24 hpf斑馬魚胚胎隨機地吸到6孔培養(yǎng)板中，每孔30個，加入不同濃度的氯氮平工作液(12.5、25、37.5、50、62.5、75、80、100 μmol·L-1)，同時設置0.1% DMSO的溶劑對照組，實驗重復3次。在48、72、96 hpf時分別于倒置熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的心率、心包水腫情況，并在SZX16型體式熒光顯微鏡下對各組進行形態(tài)學拍照。

1.3.2細胞凋亡檢測 使用AO染色試劑檢測氯氮平誘導的心肌細胞凋亡。AO是一種熒光色素染料，能透過細胞膜。正常細胞染色后呈現(xiàn)均一的綠色，凋亡細胞則呈現(xiàn)致密或顆粒狀的黃綠色[8]。隨機選擇15條72 hpf和96 hpf斑馬魚胚胎，加入終濃度為25 mg·L-1的AO溶液，于28℃培養(yǎng)箱中孵育50 min，后用PBS沖洗3遍，在體式熒光顯微鏡下進行拍照，利用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計心臟部位陽性細胞。

1.3.3RNA提取和實時定量PCR 分別在氯氮平處理24、48、72 h時收集魚卵樣本，按照納米磁珠法RNA提取試劑盒說明書抽提各處理組的總RNA，對與凋亡相關(guān)的基因表達進行分析，包括抑制凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax、caspase家族(caspase-3和caspase-9)。按照試劑盒說明書進行操作，取1 μg RNA合成cDNA，并進行定量PCR檢測，引物序列見Tab 1。以β-actin作為內(nèi)參，實驗數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt方法進行分析。

Tab 1 Primers used in real-time PCR

2 結(jié)果

2.1氯氮平對斑馬魚胚胎死亡率及形態(tài)學的作用如Fig 1A所示，氯氮平處理72 h后，隨著藥物濃度的增加，斑馬魚幼魚的死亡率逐漸增加；62.5 μmol·L-1的氯氮平導致斑馬魚全部死亡。氯氮平處理72 h的LC50值約為50 μmol·L-1。形態(tài)學檢測表明，氯氮平可劑量依賴地誘導斑馬魚出現(xiàn)體長縮短(Fig 1B)、心包水腫(Fig 1C)等毒性表型。氯氮平處理48 h后，37.5 μmol·L-1及以上濃度的斑馬魚胚胎體長明顯縮短，與溶劑對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。

2.2氯氮平導致斑馬魚胚胎心率降低如Fig 2所示，經(jīng)氯氮平處理24、48、72 h后，暴露于25 μmol·L-1及以上濃度的斑馬魚胚胎的心率明顯降低。在72 h時，暴露于50 μmol·L-1濃度氯氮平的斑馬魚每分鐘心率值為對照組的25%。

2.3氯氮平誘導斑馬魚心肌細胞凋亡AO染色的結(jié)果如Fig 3所示，對照組的斑馬魚心臟部位沒有細胞發(fā)生凋亡，但暴露于37.5、50、62.5 μmol·L-1的氯氮平后，胚胎心肌細胞開始出現(xiàn)凋亡，凋亡細胞數(shù)量增多現(xiàn)象具有劑量依賴性。

2.4氯氮平對凋亡相關(guān)基因表達水平的影響氯氮平處理斑馬魚胚胎24、48、72 h后分別收集胚胎，提取總mRNA，利用qPCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因的表達。如Fig 4、Tab 2所示，與對照組相比，經(jīng)氯氮平處理24 h后，胚胎細胞Bcl-2與Bax表達比值不變；處理48 h后，各組細胞Bax和Bcl-2表達水平均升高，但Bcl-2與Bax的比值不變；72 h后，各組細胞Bcl-2表達水平明顯降低，氯氮平(37.5、50 μmol·L-1)處理組細胞Bax表達水平上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低。此外，藥物處理48 h后，caspase-3和caspase-9的表達水平明顯上調(diào)；72 h后，caspase-9表達水平仍然升高，而caspase-3逐漸恢復正常。

Tab 2 Effects of clozapine on the mRNAexpression ratio of Bcl-2 and Bax

**P<0.01vscontrol

Fig 1 The mortality and morphologic response of zebrafish embryo to clozapine treatment

Fig 2 Effect of clozapine on heart rate of

**P<0.01vscontrol

3 討論

氯氮平是20世紀60年代末出現(xiàn)的第一種非典型抗精神病藥物，其對大腦內(nèi)5-羥色胺受體和多巴胺受體具有較強的阻滯作用，能緩解患者的幻覺、妄想、興奮躁動等癥狀，尤其對難治性精神分裂癥具有獨特療效[8]。有文獻表明，精神病患者在治療期間長期服用氯氮平會引起心肌酶水平的變化，其中以肌酸激酶(creatine kinase，CK)升高最為明顯[9]。CK相比其他酶對心肌缺血和心內(nèi)膜下心肌梗死的診斷更靈敏，急性心梗時，血清CK活力明顯升高。臨床病例報道，患者服用氯氮平第3周后，出現(xiàn)心包、胸膜的滲出性反應，停藥后該不良反應消失，排除其他感染性原因后，考慮可能是由患者的個體敏感性引起的，故在臨床應用氯氮平時應慎重[10]。

斑馬魚的心臟是第一個發(fā)育和發(fā)揮功能的器官，于22 h開始跳動，48 h心血管基本結(jié)構(gòu)形成，并表現(xiàn)出一系列復雜的離子通道和代謝過程。斑馬魚胚胎透明，可以在活體上直接觀察其心臟的形狀、大小，并可記錄心率，在心血管毒性評價研究方面優(yōu)勢明顯[11]。利用斑馬魚胚胎，研究人員對阿司咪唑的心臟毒性進行了研究，揭示了其潛在的心臟毒性副作用，證明了斑馬魚是一種有效、可靠的可快速檢測化合物心臟毒性的模式生物[12]。心率變化是評價心臟毒性的一個重要指標。本實驗發(fā)現(xiàn)，氯氮平處理后，斑馬魚胚胎心臟功能受損，心率下降明顯，而且出現(xiàn)嚴重的心包水腫，體長縮短的畸形變化，這與文獻中抗精神病藥物引起心臟毒性的結(jié)果一致[13]。

AO染色實驗證明，氯氮平誘導了斑馬魚心臟細胞凋亡。定量PCR結(jié)果也表明，給藥72 h后，斑馬魚胚胎細胞Bcl-2表達降低，Bax表達升高，Bcl-2/Bax比值明顯下降。Bcl-2和Bax都屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2具有抑制心肌細胞凋亡作用，Bax具有促進心肌細胞凋亡作用。當發(fā)生凋亡時，Bcl-2/Bax比值會下降，導致細胞色素C從線粒體釋放，進而激活caspase-9和caspase-3，誘導心肌細胞凋亡。本實驗中caspase-9的表達也出現(xiàn)升高趨勢，而caspase-3表達隨作用時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能與體內(nèi)存在的代謝補償機制有關(guān)。以上結(jié)果表明，氯氮平是通過調(diào)控Bcl-2家族基因表達，激活caspase-3和caspase-9基因表達上調(diào)而誘導斑馬魚心肌細胞凋亡。氯氮平誘導斑馬魚細胞凋亡致心臟毒性的結(jié)果與已有報道一致。據(jù)報道，氯氮平處理后的鼠血清CK同工酶和乳酸脫氫酶水平會明顯升高，同時TNF-α、MDA、NO、8-羥基脫氧鳥苷、caspase-3、NF-κB的釋放量也是增加的，這說明氧化應激、基因損傷和凋亡機制參與到了氯氮平產(chǎn)生心臟毒性的過程[14]。接下來，我們將開展氯氮平導致斑馬魚氧化應激方面的研究。

Fig 3 Effect of clozapine on apoptosis of cardiomyocyte cell in n=15)

Fig 4 Effect of clozapine on the mRNA expression of apoptosis-related n=5 )

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

綜上，本實驗采用斑馬魚模式生物對氯氮平的不良反應進行了研究，發(fā)現(xiàn)氯氮平導致斑馬魚胚胎出現(xiàn)嚴重的心臟毒性，一些表型如心率下降和水腫與臨床表現(xiàn)類似。鑒于氯氮平對于治療難治性精神失常的明顯療效，臨床上仍廣泛使用。藥物的心臟毒性作用在心電圖上會有預示[15]，故使用氯氮平時應嚴密監(jiān)測患者心電圖。通過實時觀察服藥后的癥狀，及時通過心電圖來預測心臟病變，可以在一定程度上彌補氯氮平的不良反應，繼續(xù)發(fā)揮其治療精神疾病的優(yōu)勢效果。斑馬魚胚胎的心電圖報道很少，在未來研究中，我們擬增加心電圖指標，檢測藥物心臟毒性。利用斑馬魚模型研究氯氮平的毒性反應和毒性機制，可為尋找緩解或者拮抗其副作用的藥物，提供實驗證據(jù)。今后的研究，可從聯(lián)合用藥角度，篩選保持其療效，同時降低心臟毒性的藥物，提高其用藥安全性，為氯氮平臨床使用提供更多實驗證據(jù)。

(致謝：本實驗在山東省科學院生物研究所藥物篩選重點實驗室完成，感謝本實驗的參加人員。)