熊希倩，詹江華，胡曉麗，齊美嬌

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是危及嬰幼兒生命的肝膽系統(tǒng)疾病之一，以肝內(nèi)外膽管進行性炎癥、纖維性梗阻及膽汁淤積為特點，可導致進行性肝纖維化和肝硬化，是嬰幼兒時期肝移植的主要指征。BA患兒如未接受及時治療，常在2歲內(nèi)死亡［1-2］。雖然Kasai手術(shù)的普及顯著提高了BA患兒的自體肝生存率，術(shù)后膽管炎仍是最常見且最難處理的并發(fā)癥［3］。反復發(fā)作的膽管炎導致BA患兒的自體肝生存情況不理想。Shimadera等［4］證實肝纖維化程度與Kasai術(shù)后早期膽管炎發(fā)作關系密切，肝內(nèi)膽管局部纖維化引起肝內(nèi)膽汁排出減少，易引起術(shù)后膽管炎發(fā)作。蔣宏等［5］發(fā)現(xiàn)BA患兒的肝組織和纖維斑塊存在CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤，手術(shù)吻合部位存在炎癥，這成為術(shù)后膽管炎的發(fā)病基礎。肝纖維化、肝組織炎性浸潤與Kasai術(shù)后膽管炎有關，但兩者與膽管炎的具體關系還不清楚。本文旨在闡明肝纖維化分級及炎癥細胞浸潤程度與Kasai術(shù)后膽管炎的關系，為預測Kasai術(shù)后膽管炎的發(fā)生提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源與分組 收集天津市兒童醫(yī)院普外科2015年1月—2016年12月間經(jīng)膽道造影確診為BA，且行Kasai手術(shù)的患兒92例，其中男43例，女49例；出生后初次出現(xiàn)黃疸時間為0～30 d；Kasai手術(shù)時日齡34～97 d，中位日齡59 d。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院倫理委員會討論通過。肝組織標本取自肝右葉前緣。標本經(jīng)蘇木素/伊紅（HE）、馬松（Masson）染色，按照日本Ohkuma’s肝纖維化分級標準進行分組：0級，無纖維化；Ⅰ級，肝門管區(qū)輕度纖維化；Ⅱ級，臨近門管區(qū)輕度橋接纖維化；Ⅲ級，伸向臨近門管區(qū)中度橋接纖維化；Ⅳ級，肝硬化、假小葉形成。肝纖維化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級例數(shù)分別為8、31、35、18例。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗人CD8單克隆抗體、小鼠抗人CD4、LCA、CD68單克隆抗體、二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG聚合物、3,3’-diaminobenzidine，3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。定量分析所用的ImagePro Plus 6.0自動分析系統(tǒng)購自美國Media Cybernetics公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝組織標本處理 取BA患兒肝右葉前緣，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，8～24 h后經(jīng)石蠟包埋儲存，所有過程均處于同一實驗條件。

1.3.2 HE染色 病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，蘇木素浸染5 min，經(jīng)酸化伊紅乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等一系列操作。在光學顯微鏡下（×200）觀察肝組織細胞形態(tài)、炎性細胞分類和形態(tài)、膽管增生程度、肝纖維化程度等。

1.3.3 Masson染色 病理切片脫蠟至水，蘇木素染7 min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗3 min，麗春紅酸性品紅液染8 min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理5 min，直接用核苯胺藍復染5 min，1%冰醋酸處理1 min，95%乙醇脫水多次，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片等一系列操作。在光學顯微鏡下（×40）觀察肝纖維化程度。

1.3.4 免疫組化染色 病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復15 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次，于3%H2O2中37℃孵育10 min，再用PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗［白細胞共同抗原（LCA）、T淋巴細胞表面抗原（CD4、CD8）、巨噬細胞特異性抗體（CD68）］，于冰箱中4℃過夜，次日取出置于室溫30 min，PBS洗5 min×3次，加二抗后37℃孵育30 min，PBS洗5 min× 3次，經(jīng)DAB顯色5～10 min，鏡下（×100）觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片。

免疫組化陽性標準：（1）定性分析。根據(jù)染色強度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強陽性）。（2）半定量分析。肝組織切片內(nèi)陽性細胞總光密度值/陽性細胞所占面積求得平均光密度（AOD）值。切片內(nèi)讀取任意5張視野，用同一計算機成像系統(tǒng)留取相同倍數(shù)顯微鏡下圖片，ImagePro Plus 6.0分析圖片，計算CD4、CD8、LCA、CD68蛋白的AOD。

1.4 膽管炎診斷標準 膽管炎診斷標準：出現(xiàn)無其他部位感染的發(fā)熱（體溫＞38.5℃）、進行性黃疸、無膽汁便，血常規(guī)示白細胞及C反應蛋白（CRP）升高，血清膽紅素升高。術(shù)后1個月內(nèi)發(fā)生膽管炎為早期膽管炎。術(shù)后半年內(nèi)膽管炎發(fā)作3次及3次以上為頻發(fā)膽管炎。術(shù)后黃疸持續(xù)不退的BA患兒均視為早期膽管炎和頻發(fā)膽管炎。

1.5 術(shù)后隨訪 患兒術(shù)后每月復查1次，3個月后病情穩(wěn)定改為每2～3個月復查1次，復查內(nèi)容包括血常規(guī)、肝功能、腹部彩超等。自體肝生存1年以上，可疑門靜脈高壓患兒建議行胃鏡檢查。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均應用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較滿足方差齊性采用Bonferroni法，方差非齊性采用Tamhane’s法；多組間率的比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝纖維化分級中對應的手術(shù)時日齡 肝纖維化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級患兒手術(shù)時日齡分別為（49.33±8.64）d、（52.55±15.06）d、（59.83±10.80）d、（90.19±5.86）d，4組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=41.728，P＜0.05），其中肝纖維化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級均低于Ⅳ級，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 HE染色結(jié)果 肝組織HE染色可見炎性細胞浸潤以淋巴細胞為主，肝纖維化分級為Ⅱ、Ⅲ級的BA患兒炎性浸潤程度相對較輕，見圖1。

Fig.1 HE staining results of hepatic fibrosis of grade Ⅰ～Ⅳ (×200)圖1 肝纖維化Ⅰ～Ⅳ級HE染色結(jié)果（×200）

2.3 Masson染色結(jié)果 結(jié)果顯示，Ⅰ級纖維條索沒有橋接，僅限于1個匯管區(qū)（圖2A）；Ⅱ級2個相鄰的匯管區(qū)纖維條索輕度橋接（圖2B）；Ⅲ級伸向臨近匯管區(qū)中度橋接纖維化，但假小葉尚未形成（圖2C）；Ⅳ級原有的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成（圖2D）。

Fig.2 Masson staining results of hepatic fibrosis of grade Ⅰ～Ⅳ (×40)圖2 肝纖維化Ⅰ～Ⅳ級Masson染色結(jié)果（×40）

2.4 LCA、CD4、CD8與CD68免疫組化結(jié)果 LCA蛋白標記所有的淋巴細胞（包括T淋巴細胞和B淋巴細胞等），其在所有匯管區(qū)和肝組織均呈強陽性表達，呈棕褐色（圖3A）；CD4蛋白在所有匯管區(qū)和肝組織均呈陽性表達，呈棕黃色（圖3B）；CD8蛋白主要在匯管區(qū)呈陽性表達，呈棕黃色（圖3C）；CD68蛋白在匯管區(qū)和肝組織存在表達，呈棕褐色，表達強陽性（圖3D）。

Fig.3 The immunohistochemical staining results of LCA,CD4,CD8 and CD68（×100）圖3 LCA、CD4、CD8與CD68免疫組化染色結(jié)果（×100）

2.5 LCA、CD4、CD8及CD68免疫組化半定量分析結(jié)果 LCA、CD4、CD8及CD68在不同肝纖維化分級表達情況見表1。LCA、CD4、CD8三種蛋白的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LCA、CD4蛋白在肝纖維化Ⅳ級BA患兒肝組織的表達含量明顯高于肝纖維化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，Ⅰ級高于Ⅱ、Ⅲ級；CD8蛋白肝纖維化Ⅳ級BA患兒肝組織的表達含量明顯高于其他3組（P＜0.05）；CD68蛋白的表達水平在不同的肝纖維化分級組中差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

Tab.1 Expressions of LCA,CD4,CD8 and CD68 proteins in different grade groups表1 LCA、CD4、CD8及CD68蛋白在不同肝纖維化分級組中的表達 （OD值，±s）

Tab.1 Expressions of LCA,CD4,CD8 and CD68 proteins in different grade groups表1 LCA、CD4、CD8及CD68蛋白在不同肝纖維化分級組中的表達 （OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與Ⅰ級比較，b與Ⅱ級比較，c與Ⅲ級比較，P＜0.05

肝纖維化分級Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級F n 83 1 35 18 LCA 0.115±0.015 0.093±0.007a 0.101±0.007a 0.130±0.010abc 40.957＊＊CD4 0.111±0.007 0.072±0.003a 0.067±0.005a 0.096±0.010abc 92.164＊＊CD8 0.066±0.005 0.061±0.007 0.067±0.004 0.082±0.006abc 36.532＊＊CD68 0.120±0.028 0.136±0.031 0.113±0.018 0.125±0.026 0.821

2.6 Kasai術(shù)后膽管炎發(fā)生情況 92例BA患兒均獲得短期隨訪，本組中有50例患兒發(fā)生膽管炎；早期膽管炎38例；頻發(fā)膽管炎23例。不同肝纖維化分級BA患兒Kasai術(shù)后膽管炎、早期膽管炎和頻發(fā)膽管炎的發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），肝纖維化Ⅳ級患兒術(shù)后膽管炎、早期膽管炎和頻發(fā)膽管炎發(fā)生率均高于Ⅱ級（P＜0.008 3），見表2。

Tab.2 The incidence of cholangitis after Kasai surgery表2 Kasai術(shù)后膽管炎發(fā)生情況 ［例（%）］

3 討論

膽管炎作為Kasai術(shù)后常見又難以處理的并發(fā)癥，多在術(shù)后早期發(fā)生，其發(fā)生率約為60%～90%［6］。膽管炎反復發(fā)作嚴重影響Kasai手術(shù)效果，防治膽管炎對改善BA患兒預后、延長自體肝生存時間具有重要意義［7］。董淳強等［8］認為在肝門部炎癥較穩(wěn)定且肝纖維化程度較輕時進行Kasai手術(shù)能獲得良好的膽汁引流，證實膽管炎的發(fā)生與行Kasai手術(shù)時肝纖維化程度和肝組織的炎性浸潤密切相關。

3.1 肝纖維化分級與Kasai術(shù)后膽管炎的關系 本研究中肝纖維化Ⅱ、Ⅲ級BA患兒Kasai術(shù)后發(fā)生膽管炎比例較低，早期發(fā)生膽管炎的情況較少，基本上沒有頻發(fā)膽管炎的發(fā)生，而肝纖維化Ⅳ級患兒術(shù)后膽管炎發(fā)生率最高，早期膽管炎和頻發(fā)膽管炎比較常見。本研究結(jié)果證實肝纖維化程度與早期膽管炎發(fā)作關系密切。肝纖維化嚴重時，肝門部纖維斑塊中開放細微膽管的數(shù)量相應減少，肝內(nèi)膽管局部因肝纖維化導致區(qū)域引流障礙，直接導致膽汁排出通暢性降低，易引起術(shù)后早期膽管炎發(fā)作［4，9］。本組中肝纖維化Ⅰ級BA患兒Kasai術(shù)后膽管炎的發(fā)生率較Ⅱ、Ⅲ級高。肝纖維化較輕時，肝門部纖維斑塊形成不佳，纖維斑塊剝離后剩余的肝門部膽管缺乏支撐，容易再次發(fā)生閉塞，增加Kasai術(shù)后膽管炎發(fā)生率［10］。彭飛等［11］認為肝門部存在纖維斑塊的BA患兒術(shù)后黃疸消退率及2年自體肝存活率明顯高于缺乏纖維斑塊的患兒，肝門部較多的小膽管起到相對較好的膽汁引流作用，減輕了膽汁淤積對肝臟的持續(xù)損傷，提高了患兒生存質(zhì)量。因此，肝纖維化Ⅰ級BA患兒Kasai術(shù)后膽管炎發(fā)生率較肝纖維化Ⅱ、Ⅲ級BA患兒高的原因可能與已經(jīng)開放的膽管缺乏支撐，再次發(fā)生梗阻有關。

3.2 肝組織炎性細胞浸潤與Kasai術(shù)后膽管炎的關系 Kasai術(shù)后膽管炎與炎性細胞浸潤的關系研究普遍圍繞T淋巴細胞亞群展開。本研究結(jié)果證實BA患兒肝組織炎性細胞浸潤以淋巴細胞為主，還存在少量的巨噬細胞，可見淋巴細胞浸潤程度與術(shù)后膽管炎發(fā)生關系密切。

LCA蛋白在淋巴細胞中表達，但因其表達的特異性差，相關研究不多。Mack等［12］發(fā)現(xiàn)BA患兒肝組織中CD4+T細胞在匯管區(qū)表達明顯高于正常的肝組織。Sakamoto等［13］發(fā)現(xiàn)BA動物模型肝門淋巴結(jié)中CD4+調(diào)節(jié)性T細胞聚集，是外周血的2倍左右。Guo等［14-15］認為CD8+T細胞能促進膽管上皮細胞的破壞，加快炎性進程，在BA纖維化中發(fā)揮重要作用。本研究證實LCA、CD4、CD8表達水平隨著肝纖維化程度的加重呈先下降后上升的趨勢，即肝纖維化分級為Ⅱ、Ⅲ級，上述蛋白表達量較低，說明此時淋巴細胞尤其是T淋巴細胞浸潤較輕。結(jié)合Kasai術(shù)后膽管炎的隨訪資料，此時膽管炎的發(fā)生率也較低，可以推測Kasai術(shù)時肝組織的炎性浸潤程度可以作為Kasai術(shù)后膽管炎發(fā)生的一個預測指標。但Derkow等［16］發(fā)現(xiàn) CD8+T 細胞越少，CD4+/CD8+比例越低的BA患兒預后越差。因此，CD8+T淋巴細胞的表達量與膽管炎發(fā)生的關系還需要進一步實驗來驗證。本研究證實Kasai術(shù)后膽管炎發(fā)生與Kasai術(shù)時肝組織CD4+T淋巴細胞浸潤有關，與文獻報道的結(jié)論一致。

綜上，Kasai術(shù)后膽管炎與肝纖維化程度和肝臟炎性浸潤密切相關，肝組織肝纖維化程度和炎性細胞表達水平可以作為預測Kasai術(shù)后膽管炎的發(fā)生的重要指標之一，可以用于指導膽管炎預防用藥。