陸 帥， 何子凡， 廖紫薇， 曾成武， 楊力建， 陳少華， Suming HUANG， 李揚(yáng)秋△

(暨南大學(xué) 1再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所， 廣東 廣州 510632；3佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)系， 美國(guó) 佛羅里達(dá)州 蓋恩斯維爾 326100245)

T細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一類(lèi)惡性程度高、療效差、預(yù)后不良的血液腫瘤[1]。由于T細(xì)胞在發(fā)育和分化時(shí)涉及T細(xì)胞受體重排和基因重組過(guò)程，導(dǎo)致T-ALL發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。國(guó)外學(xué)者和我們的前期研究均發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukemia 11 B，BCL11B)在T細(xì)胞腫瘤中異常高表達(dá)，下調(diào)BCL11B的表達(dá)可抑制白血病T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，提示BCL11B在T細(xì)胞腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[2-6]。BCL11B異常表達(dá)的分子機(jī)制尚不明確，BCL11B基因異常重排和編碼區(qū)突變僅見(jiàn)于個(gè)別病例，而其表觀調(diào)控情況研究甚少[7-8]，故本研究首先分析健康人和T-ALL患者細(xì)胞中BCL11B基因 3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region, 3’UTR)微小RNA(microRNA, miRNA)結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)和突變情況，了解其是否在BCL11B表達(dá)異常中發(fā)揮調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 樣本

本研究選取經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫表型分析確診的T-ALL病人21例(男17例，女4例; 年齡7～45歲，中位年齡22歲)及健康體檢人員20例(男9例，女11例; 年齡20～74歲,中位年齡32歲)，收集EDTA-K2抗凝靜脈血2～3 mL,按常規(guī)方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，同時(shí)，收集本實(shí)驗(yàn)室保留的2種白血病T細(xì)胞株(CCRF-CEM細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞)及1種白血病B細(xì)胞株(Raji細(xì)胞)，分別提取DNA用于后續(xù)研究。

2 BCL11B-3’UTR主要miRNA結(jié)合區(qū)域預(yù)測(cè)和引物設(shè)計(jì)

從NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取BCL11B-3’UTR序列信息，BCL11B-3’UTR位于第4外顯子上，全長(zhǎng)共4 864 bp。通過(guò)TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)和RegRNA 2.0 (http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)等生物學(xué)軟件分析miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并根據(jù)預(yù)測(cè)的主要miRNA結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物(表1)，用于PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，分析其核苷酸序列。

表1 用于擴(kuò)增BCL11B-3’UTR區(qū)域的引物序列

3 PCR

利用所設(shè)計(jì)4對(duì)引物分別采用PCR擴(kuò)增每一個(gè)樣本，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為30 μL: ddH2O 13.2 μL，5×PCR Buffer 6 μL，dNTP(1 mmol/L)3 μL， MgCl2(15 mmol/L) 3 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，基因組DNA 1.5 μL (約100 ng)。陰性對(duì)照加入等體積ddH2O。PCR在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s、60 ℃(擴(kuò)增片段3的PCR中退火溫度為61 ℃)1 min、72 ℃ 1 min，循環(huán)34次；最后72 ℃ 10 min。擴(kuò)增所得產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小和特異性，選取陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行核苷酸序列分析。

結(jié) 果

1 BCL11B-3’UTR miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

TargetScan和RegRNA 2.0軟件分析全長(zhǎng)4 864 bp的 BCL11B-3’UTR，發(fā)現(xiàn)其中存在多個(gè)潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)seed match類(lèi)型和context++ score等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(評(píng)分>90)篩選得到24個(gè)高度保守的潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，其中已有部分報(bào)道有SNP，見(jiàn)表2[9]。

2 BCL11B-3’UTR miRNA結(jié)合位點(diǎn)片段擴(kuò)增結(jié)果

由于BCL11B-3’UTR序列過(guò)長(zhǎng)且含有多個(gè)多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)，難以一次性擴(kuò)增全長(zhǎng)片段和進(jìn)行核苷酸序列分析，因此本研究根據(jù)表1中高度保守的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的分布分別設(shè)計(jì)4對(duì)引物擴(kuò)增相應(yīng)片段(66～830 bp、1 365～1 993 bp、2 079～2 988 bp和4 369～4 731 bp)，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，結(jié)果顯示產(chǎn)物片段大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

表2 BCL11B基因3’UTR的miRNA結(jié)合位點(diǎn)

Figure 1. Analysis of PCR amplification products by agarose gel electrophoresis. M： 100 bp DNA ladder； 1～4: PCR products amplified from healthy DNA samples using 4 primer pairs, respectively. The size of PCR products were consistent as expected 655 bp, 629 bp, 910 bp and 363 bp, respectively.

圖1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

3 健康人和T-ALL患者BCL11B-3’UTR miRNA結(jié)合位點(diǎn)核苷酸序列分析結(jié)果

利用特異性引物擴(kuò)增包含BCL11B-3’UTR miRNA預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的4對(duì)引物，對(duì)所收集的21例T-ALL病人和20例健康人基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，絕大部分樣本均可擴(kuò)增到所有4個(gè)基因片段產(chǎn)物，但部分樣本未能擴(kuò)增到1～2個(gè)基因片段產(chǎn)物，所擴(kuò)增的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物直接進(jìn)行核苷酸序列測(cè)序分析，并使用MEGA 6序列分析軟件對(duì)樣品測(cè)序結(jié)果和基因庫(kù)中BCL11B-3’UTR參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示：20例健康人及CCRF-CEM、Molt-4和Raji細(xì)胞株的BCL11B-3’UTR中所檢測(cè)的區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)SNP和突變情況，而在21例T-ALL樣本中，僅發(fā)現(xiàn)1例存在BCL11B-3’UTR第2 402位點(diǎn)發(fā)生核苷酸替換(T>C)，該突變屬于NCBI-dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)登記的SNP(rs184678181)，登記突變頻率為0.000 2,見(jiàn)圖2。

Figure 2. Sequencing analysis results from part of BCL11B-3’UTR. Left figure: nucleotide sequence between segment of 2 400～2 407 bp ofBCL11Bgene from 8 samples, and T>C was showed in No.5 sample from a patient with T-ALL； right figure: results of sequencing, arrows indicated the wild type (TT) and heterozygous mutation (TC) position.

圖2BCL11B-3’UTR部分核苷酸序列分析結(jié)果

討 論

BCL11B基因定位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂14q32.31位點(diǎn)，與T細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)α/δ基因座相鄰，主要表達(dá)于T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和腦組織中。BCL11B mRNA為7 623 bp(編碼區(qū)268～2 739 bp)， 編碼蛋白為824氨基酸[10]。有關(guān)BCL11B定向調(diào)控靶點(diǎn)的研究不多，有一研究顯示了BCL11B表達(dá)受其下游850 kb的一個(gè) 1.9 kb區(qū)域順式調(diào)節(jié)元件與其啟動(dòng)子近端相互作用而調(diào)控[11]。有關(guān)BCL11B-3’UTR下游調(diào)控的研究罕見(jiàn)，有一報(bào)道是在神經(jīng)系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)miR-9/9(*)和miR-124與BCL11B等基因調(diào)控相關(guān)[12]。而在正常T細(xì)胞和T細(xì)胞腫瘤中，尚未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。基于BCL11B在T細(xì)胞發(fā)育分化以及T細(xì)胞腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，分析其可能的調(diào)控靶點(diǎn)顯得非常重要。本研究首先利用TargetScan和RegRNA 2.0軟件分析BCL11B-3’UTR的潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并根據(jù)seed match類(lèi)型和context++ score等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以評(píng)分>90篩選獲得24個(gè)高度保守的潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)相應(yīng)的4對(duì)引物，擴(kuò)增覆蓋這些位點(diǎn)的基因片段，也同時(shí)覆蓋了部分評(píng)分較低的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。

從20例健康人樣本的分析結(jié)果看，這些BCL11B-3’UTR主要miRNA結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域均高度保守，未發(fā)現(xiàn)任何基因多態(tài)性和突變情況。在2種常見(jiàn)的白血病T細(xì)胞株CCRF-CEM和Molt-4中也均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變。而在21例T-ALL樣本的分析結(jié)果也相似，僅在1例(4.76%)T-ALL樣本發(fā)現(xiàn)BCL11B-3’UTR中第2 402位點(diǎn)發(fā)生核苷酸替換(T>C)，該突變可在NCBI-dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)登記資料查到屬于一種SNP(rs184678181)，其頻率為0.000 2，但尚未在健康人和病人樣本的研究中報(bào)道。本研究在21例T-ALL中發(fā)現(xiàn)1例存在該SNP，雖然發(fā)生頻率為4.76%，但由于樣本數(shù)較少，還有待進(jìn)一步大樣本分析研究。盡管該SNP位點(diǎn)不在我們預(yù)測(cè)的24個(gè)高度保守的潛在BCL11B-3’UTR的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，我們進(jìn)一步分析BCL11B-3’UTR中評(píng)分低于90的miRNA位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，BCL11B-3’UTR第2 399～2 405位點(diǎn)為hsa-miR-6814-5p的結(jié)合位點(diǎn)，其評(píng)分為88，接近90分，也屬于較高保守的潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，其改變也可能存在對(duì)BCL11B的影響，但仍有待進(jìn)一步確定其對(duì)BCL11B表達(dá)的調(diào)控作用。

既往研究中，有報(bào)道T細(xì)胞腫瘤中存在BCL11B基因突變和重排情況，如在一例伴有t(6;14)(q25;q32)混合型(T細(xì)胞和髓細(xì)胞)急性白血病中，28S核糖體DNA基因(RN28S1)與BCL11B重排形成一個(gè)新的融合基因，與RN28S1相關(guān)的融合基因都發(fā)揮促腫瘤發(fā)生的作用，而在一個(gè)102例T-ALL的研究中，發(fā)現(xiàn)BCL11B的第4外顯子出現(xiàn)高突變頻率(14%)[13-14]。但這些研究主要涉及BCL11B編碼區(qū)的改變，對(duì)于T-ALL中普遍性BCL11B高表達(dá)的機(jī)制，仍需進(jìn)一步從BCL11B調(diào)控因素改變的角度加以認(rèn)識(shí)。