齊汝霞， 張 鵬， 孫 濤， 楊欣欣， 程葆華△

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 1藥理學(xué)教研室， 2解剖學(xué)教研室， 3臨床醫(yī)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是腦血管疾病引起的以大腦認(rèn)知和記憶功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的臨床綜合征，是老年性癡呆的常見(jiàn)的病因之一。60 歲以上老年人發(fā)生腦缺血性疾病后，約26.3%患者繼發(fā)癡呆。隨著人口老齡化及腦卒中治療后存活率的提高，VD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量。VD是老年性癡呆中唯一可以防治的癡呆，如果早期治療具有可逆性[1]。?；撬崾且环N含硫的非蛋白氨基酸，在海馬、大腦皮層和小腦等神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富。?；撬嵬ㄟ^(guò)提高抗氧化酶活性，產(chǎn)生抗炎抗氧化作用[2]；降低大腦組織中脂褐質(zhì)的含量，提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性；拮抗興奮性遞質(zhì)谷氨酸的毒性，有效清除腦內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[3]。?；撬嵬ㄟ^(guò)抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2) 的激活，減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[4]。鋅是人體必需的微量元素之一，調(diào)節(jié)人體生長(zhǎng)發(fā)育、內(nèi)分泌、免疫和生殖遺傳等生理功能，內(nèi)源性鋅通過(guò)NMDA受體激活離子通道，還可以激活NMDA受體，目前認(rèn)為NMDA受體是缺鋅影響學(xué)習(xí)和記憶的重要機(jī)制之一[5]。牛磺酸鋅(taurine-zinc，TZC)是?；撬岷蜔o(wú)機(jī)鋅鹽的螯合物, 作為一種新的治療藥物或金屬元素補(bǔ)充劑[6]，其對(duì)血管性癡呆小鼠的記憶功能是否有保護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)此，本研究旨在觀察?；撬徜\對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響，通過(guò)檢測(cè)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達(dá)和一氧化氮(nitric oxide，NO)含量,進(jìn)一步探討其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康昆明種小鼠60只，雄性，體重20～25 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(魯)20130001。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在恒溫、恒濕實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食，自由飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品 ?；撬徜\，純度 99%，醫(yī)藥食品級(jí)(石家莊維平功能食品科技有限公司)；醋酸地塞米松注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字20000462)；水合三氯乙醛(上海白鶴化工廠，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673)；TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 計(jì)重秤ACS-D11(上海乾峰電子儀器有限公司)；BS2242電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；程控水迷宮SMG-2(醫(yī)科院藥研所)；跳臺(tái)自動(dòng)測(cè)試儀DT-200(成都泰盟科技有限公司)；MK3型酶標(biāo)儀(Labsystem Dragon)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法 將小鼠隨機(jī)分為5組：模型(model)組、假手術(shù)(sham)組、TZC 50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg組。給藥組按10 mL/kg灌胃，模型組和假手術(shù)組均給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d后造模。

2.2血管性癡呆模型的制備 小鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血再灌注法制備VD動(dòng)物模型。用10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，消毒后，在頸部正中切開(kāi)并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，暫時(shí)性?shī)A閉雙側(cè)頸動(dòng)脈造成腦缺血，20 min后，再灌注10 min，連續(xù)2次，同時(shí)尾部放血大約 0.3 mL[7]。假手術(shù)組小鼠只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不夾閉動(dòng)脈，也不進(jìn)行尾部放血，觀察時(shí)間與其它組相同。造模后腹腔注射鹽酸地塞米松注射液50 mL/kg。術(shù)后觀察小鼠肢體癱瘓，站立，肢體屈曲和行走情況。采用Longa的“5分法”進(jìn)行神經(jīng)學(xué)評(píng)分，一側(cè)前肢不能完全伸直，向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，行走向一側(cè)傾斜，均為有效模型[8]。

2.3ELISA法檢測(cè)TNF-α和 IL-1β含量 造模成功后6 h，取大腦組織100 mg，按1∶9比例加入冰生理鹽水，制成10%腦組織勻漿，在4 ℃、 3 500 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度，分別按其ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α和IL-1β。

2.4腦組織中iNOS和NO水平的測(cè)定 造模成功后24 h用分光光度法檢測(cè)VD小鼠腦組織iNOS和NO的濃度變化。術(shù)后24 h脫臼處死小鼠后，立即在冰浴中取其腦組織，用冰生理鹽水沖洗，制成10%的組織勻漿，取上清液50 μL用分光光度計(jì)在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度(A值)，計(jì)算iNOS活力(×103U/g)，取上清液用硝酸還原酶法在550 nm下測(cè)其吸光度(A值)，進(jìn)行NO含量(μmol/L)的測(cè)定。

2.5小鼠的行為學(xué)檢測(cè) 造模后第3天繼續(xù)按上述方法灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后第20～24天進(jìn)行小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)；術(shù)后第27～29天進(jìn)行小鼠的跳臺(tái)實(shí)驗(yàn),測(cè)試小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

2.5.1水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮以棕黑色有機(jī)樹(shù)脂玻璃為材料，數(shù)個(gè)垂直擋板構(gòu)成的立方形槽式水池。大小為80 cm×37 cm×20 cm，水深12 cm，水溫22～25 ℃。擋板構(gòu)成的通道有4個(gè)視覺(jué)盲點(diǎn)。水池右下方迷宮的出口處有10層臺(tái)階供小鼠游出水面。測(cè)試需要3 d，前2 d為訓(xùn)練期，第3天是實(shí)驗(yàn)期，訓(xùn)練期每天訓(xùn)練2次，每次約120 s，小鼠從左上角入水到達(dá)臺(tái)階，在臺(tái)階上停留5 s，一次訓(xùn)練完成。實(shí)驗(yàn)從小鼠入水時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，小鼠到達(dá)臺(tái)階終點(diǎn)時(shí)計(jì)時(shí)結(jié)束。小鼠從起點(diǎn)到達(dá)臺(tái)階的時(shí)間即為“潛伏期”，當(dāng)小鼠2 min內(nèi)游回臺(tái)階記錄時(shí)間，若小鼠2 min內(nèi)無(wú)法游回臺(tái)階則記錄為120 s，由實(shí)驗(yàn)員引導(dǎo)至臺(tái)階停留5 s，記錄錯(cuò)誤次數(shù)。

2.5.2跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 小鼠跳臺(tái)反應(yīng)箱大小80 cm×20 cm×20 cm，分為2間。箱底為提供24～32 V連續(xù)電刺激的銅柵，每間右后角設(shè)置一個(gè)高度為4 cm，直徑也為4 cm的橡膠墊，可作為小鼠回避電擊的安全區(qū)。訓(xùn)練時(shí)先將小鼠放入儀器中適應(yīng)3 min，然后將小鼠置于儀器內(nèi)的安全區(qū)，設(shè)定試驗(yàn)參數(shù)后底部通上28 V的電流，當(dāng)小鼠從跳臺(tái)上跳下四肢接觸銅柵時(shí)會(huì)受到電擊，正常的回避反應(yīng)是跳上跳臺(tái)返回安全區(qū)。小鼠受到電擊后跳上安全區(qū)的時(shí)間為潛伏期，5 min內(nèi)受電擊次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)，作為小鼠學(xué)習(xí)能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。24 h后正式實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，先采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，后采用SNK(Student-Newman-Keuls)法進(jìn)行兩兩比較q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β表達(dá)的變化

與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α和IL-1β均升高(P<0.05)；與模型組比較，TZC 50 mg/kg組、TZC 100 mg/kg組和200 mg/kg組中TNF-α表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)，且劑量越大，作用越強(qiáng),TZC 50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組中IL-1β含量減少(P<0.05)，但無(wú)劑量依賴性，見(jiàn)表1。

表1各組小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β表達(dá)的比較

Table 1. The expression of TNF-α and IL-1β in the brain tissues (μg/g. Mean±SD)

GroupnTNF?αIL?1β Sham100．137±0．0650．332±0．076 Model100．172±0．044△0．499±0．050△ TZC50mg/kg90．159±0．087?0．407±0．032? TZC100mg/kg100．163±0．005?0．396±0．083? TZC200mg/kg100．141±0．032??0．351±0．057?

△P<0.05vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

2 各組小鼠腦組織iNOS和NO比較

與假手術(shù)組相比，模型組的iNOS和NO均升高(P<0.05)；與模型組比較，TZC 50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組的iNOS活性降低(P<0.05或P<0.01)，TZC 50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組NO含量明顯減少(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2各組小鼠腦組織iNOS活性和NO含量比較

Table 2. Comparison of iNOS activity and NO content (Mean±SD)

GroupniNOS(×103U/g)NO(μmol/L) Sham120．67±0．095．02±5．73 Model90．93±0．31△10．91±2．18△△ TZC50mg/kg80．74±0．26?5．20±3．34? TZC100mg/kg90．63±0．17?5．17±3．01? TZC200mg/kg90．29±0．14??4．57±1．22??

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

3 各組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較

與假手術(shù)組比較，模型組在小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.01)，潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，TZC 50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組小鼠在水迷宮錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)，TZC 100 mg/kg和200 mg/kg組潛伏期明顯縮短(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3各組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的比較

Table 3. Comparison of latency and error times in water maze test (Mean±SD)

GroupnLatency(s)Errortimes Sham1251．2±37．35．5±2．9 Model975．4±23．6△11．4±3．3△△ TZC50mg/kg867．8±41．67．9±4．3? TZC100mg/kg944．2±18．2?4．7±2．4?? TZC200mg/kg920．1±7．1?5．1±3．2??

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

4 各組小鼠在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較

與假手術(shù)組比較，模型組在小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.05)，潛伏期明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，TZC 50 mg/kg組、100 mg/kg和200 mg/kg組錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)，TZC 50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組小鼠的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4各組小鼠在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)的比較

Table 4. Comparison of latency and error times in step-down test (Mean±SD)

GroupnLatency(s)Errortimes Sham12181．3±85．60．5±0．6 Model949．8±37．9△1．4±0．5△ TZC50mg/kg8143．8±92．1?0．7±0．8? TZC100mg/kg9177．5±106．3??0．6±0．5? TZC200mg/kg9203．4±89．5??0．4±0．6?

△P<0.05vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

討 論

腦缺血是引起血管性癡呆和阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注方法，制備VD模型，造成小鼠進(jìn)行性的學(xué)習(xí)和記憶損傷。利用水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，觀察TZC對(duì)VD小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響；檢測(cè)小鼠腦組織TNF-α、IL-1β、iNOS和NO水平的變化，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

NO在腦缺血過(guò)程中發(fā)揮重要作用，一方面與缺血產(chǎn)生的氧自由基協(xié)同作用，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷[9]；另一方面可以縮小梗死范圍，增加皮質(zhì)供血[10]。NOS是NO合成過(guò)程中的重要限速酶，iNOS是NOS中的一種，其在病理情況下表達(dá)后，可以生成大量的NO，過(guò)多的NO具有一定的細(xì)胞毒性作用[11]，大量神經(jīng)毒性物質(zhì)的分泌，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，使機(jī)體記憶功能減退。NO通過(guò)抑制線粒體呼吸功能和糖酵解功能、造成細(xì)胞能量代謝障礙，進(jìn)而抑制DNA合成并損害DNA結(jié)構(gòu)[12]。高濃度NO不但可生成NO-自由基，NO還可與超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化亞硝?；x子(ONOO-)。大量氧自由基的生成，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡及腦組織損傷[13]，進(jìn)而影響機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能，因此，NO含量升高是引發(fā)VD的重要病理生理學(xué)機(jī)制之一。本研究顯示，TZC降低iNOS 活性，減少NO的產(chǎn)生；TZC干預(yù)后小鼠在水迷宮中的潛伏期明顯縮短、錯(cuò)誤次數(shù)減少，且具有劑量依賴性，證實(shí)其能改善VD小鼠的空間定向?qū)W習(xí)障礙。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是觀察動(dòng)物的被動(dòng)回避能力，反應(yīng)其記憶力的高低，TZC高、中、低劑量組均可使小鼠的跳臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，說(shuō)明其可提高VD小鼠的記憶能力。以上結(jié)果提示TZC通過(guò)降低iNOS 活性、減少NO生成，阻止腦缺血所致神經(jīng)元的進(jìn)行性損傷，提高VD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

已有研究證實(shí)，腦缺血后，腦組織中某些炎性因子如TNF-α和IL-1β等表達(dá)增加，介導(dǎo)神經(jīng)毒作用，引起神經(jīng)元損傷[11]，導(dǎo)致與記憶有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、去甲腎上腺素和5-羥色胺等的減少，促使 VD 的發(fā)生。而這些炎性因子也能從基因水平增加細(xì)胞內(nèi)iNOS 的表達(dá)[14]。預(yù)先應(yīng)用TZC治療后，腦缺血后6 h腦組織中TNF-α和IL-1β表達(dá)減少，且呈明顯的量效關(guān)系，說(shuō)明TZC通過(guò)降低炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-1β的表達(dá)，產(chǎn)生一定抗炎作用，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)元的損傷。腦缺血24 h后發(fā)現(xiàn)iNOS和NO含量減少，證明其與TNF-α和IL-1β表達(dá)下降有相關(guān)性，與資料相符。

綜上所述，TZC可提高VD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。其機(jī)制可能與其降低腦組織TNF-α、IL-1β、iNOS和NO水平，產(chǎn)生對(duì)VD小鼠早期的神經(jīng)保護(hù)功能有關(guān)。腦缺血導(dǎo)致VD的機(jī)制是非常復(fù)雜的，TZC中的牛磺酸和鋅對(duì)VD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能有何影響以及TZC能否通過(guò)其它途徑發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。