趙良淵， 侯曉敏, 秦小江

(山西醫(yī)科大學 1體育教學部， 2基礎醫(yī)學院， 3公共衛(wèi)生學院， 山西 太原 030001)

血管舒張功能減弱是高血壓的發(fā)病原因之一[1]。在血管壁的結(jié)構(gòu)中，主要調(diào)控血管舒縮活動的是血管中膜，而血管中膜主要由血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)組成。VSMCs收縮可減小血管直徑，進而引起血壓的升高，反之VSMCs舒張則可降低血壓[2]。α1-腎上腺素能受體(α1-adrenergic receptor,α1-AR)主要包括α1A、α1B和α1D3種亞型[3]，其中α1A和α1D對血壓的調(diào)節(jié)非常重要，且有研究表明α1D亞型參與VSMCs的收縮與舒張相關信號調(diào)控過程[4-5]，而胞內(nèi)Ca2+濃度及鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)水平與VSMCs的收縮活動密切相關[4-7]。本課題組此前對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)和正常對照大鼠(Wistar-Kyoto RAT，WKY大鼠)的主動脈組織進行全基因表達譜檢測，發(fā)現(xiàn)與WKY大鼠相比，SHR的Adra1d基因(α1D-AR的基因)表達量顯著升高[8]。因此我們推測，Adra1d基因可通過調(diào)控Ca2+濃度及CaM的表達對VSMCs的舒縮活動進行調(diào)節(jié)。

針對Adra1d基因的mRNA編碼區(qū)設計同源shRNA，把shRNA與載體質(zhì)粒GV248結(jié)合為重組質(zhì)粒并導入慢病毒內(nèi)。慢病毒侵染大鼠主動脈VSMCs后，病毒攜帶的shRNA被導入大鼠主動脈VSMCs中并與之基因組相結(jié)合，從而導致Adra1d基因表達沉默，且shRNA可以在細胞中被穩(wěn)定表達[9]，可保證3代以上細胞的轉(zhuǎn)染效果。本實驗針對Adra1d基因設計進行RNA干擾(RNA interference, RNAi)實驗，建立shRNA慢病毒表達載體，探討Adra1d基因與大鼠主動脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度和CaM變化的關系。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

雄性SD大鼠，150～180 g，購自山西醫(yī)科大學動物中心，許可證號為SCXK(晉)2009-0001。HEK293細胞(上海中科院細胞庫)。

慢病毒載體GV248(吉凱基因化學技術有限公司)；Lipofectamine 2000(Thermo Scientific)；兔抗鼠 Adra1d多克隆抗體(Abcam)。

2 方法

2.1原代VSMCs的培養(yǎng)及鑒定 大鼠麻醉后，快速取其胸主動脈，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs。選取第4～6代細胞進行實驗。采用免疫組化染色法對VSMCs進行鑒定，I 抗為抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體，胞質(zhì)著棕色的細胞為VSMCs。

2.2Adra1dshRNA慢病毒載體的構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選 根據(jù)分析結(jié)果，設計得到4條shRNA靶點序列。另外，選擇scrambled序列[10]作為RNAi陰性轉(zhuǎn)染組。設計得到的shRNA1序列為5’-GCTCAAGTACCCAGCCATTAT-3’，shRNA2序列為5’-GCCAAAGGATATCCCGGAACA-3’，shRNA3序列為5’-GCTGTCATCTGCCAGGCTTAT-3’，shRNA4序列為5’-AAACTACTTAGTCAACTCCTA-3’，scramble序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

根據(jù)以上shRNA靶點序列，分別設計合成正、反2條單鏈寡核苷酸。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，擴增得到shRNA-Adr載體。寡核苷酸序列見表1。

表1 合成的shRNA寡核苷酸序列

對載體進行酶切、退火、連接、轉(zhuǎn)化、菌落鑒定等操作[11-12]。5種質(zhì)粒分別命名為shRNA1-Adr、shRNA2-Adr、shRNA3-Adr、shRNA4-Adr和scrambled。

用RT-qPCR篩選干擾效果。分別用shRNA1-Adr、shRNA2-Adr、shRNA3-Adr、shRNA4-Adr、scrambled載體與表達載體共同轉(zhuǎn)染293T細胞，測定Adra1d mRNA的表達水平。Adra1d的正向引物序列為5’-TCAAGCCTACT CAACTGCTGG-3’，反向引物序列為5’-TGTTACAACGAAAGGCAGACTG-3’；β-actin的正向引物序列為5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，反向引物序列為5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’。

選定合適的shRNA載體，將其與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。5種病毒分別命名為Lv-shRNA1-Adr、Lv-shRNA2-Adr、Lv-shRNA3-Adr、Lv-shRNA4-Adr和Lv-scrambled。對慢病毒進行濃縮純化，測定滴度和感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。用含8 mg/L轉(zhuǎn)染增強液的培養(yǎng)液對慢病毒原液稀釋，使其MOI值分別為15、30、45、60和75。用不同MOI值的稀釋液培養(yǎng)VSMCs。

將VSMCs接種入96孔板中，培養(yǎng)過夜。24 h后，細胞匯合度達30%～40%可進行轉(zhuǎn)染。向VSMCs加入最適MOI值的稀釋后培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染12 h后換液。3 d后，更換為含1 μg/L嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基。20 d后，向VSMCs中加入含0.5 μg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液。凍存同一批次的細胞20支備用。

2.3RT-qPCR檢測Adra1d和CaM的mRNA表達 收集轉(zhuǎn)染后的VSMCs測定Adra1d mRNA的相對表達量。分別收集正常和轉(zhuǎn)染的VSMCs測定CaM mRNA相對表達量。以β-actin為內(nèi)參照。冰上收集細胞并裂解，提取總RNA。CaM的正向引物序列為3’-ACTCCACCTACGACTACC-5’，反向引物序列為 5’-TGAGGTGGATGCTGATGG- 3’。依據(jù)說明加入反轉(zhuǎn)錄體系，室溫放置10 min，之后42 ℃和95 ℃下分別15 min和5 min，反轉(zhuǎn)錄之后得cDNA模板。將模板加入擴增反應，反應條件為： 95 ℃ 45 s， 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，連續(xù)循環(huán)30次；最后在72 ℃條件下持續(xù)5 min。計算CaM mRNA的相對表達量。

2.4Western blot檢測Adra1d和CaM蛋白的表達 收集轉(zhuǎn)染后的VSMCs測定Adra1d的蛋白表達量。分別收集正常的和轉(zhuǎn)染后的VSMCs測定CaM的蛋白表達量。以β-actin為內(nèi)參照。冰上收集細胞并裂解，提取蛋白質(zhì)。取40 μg蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離，恒壓電轉(zhuǎn)到NC膜上，脫脂牛奶封閉 3 h， TBST 連續(xù)3次洗膜。將NC膜置于相應的Ⅰ抗溶液中(CaM稀釋比例為1 ∶1 000，β-actin稀釋比例為1∶4 000)，4 ℃過夜。用TBST連續(xù)3次洗膜，然后將膜置于HRP標記的Ⅱ抗(稀釋比例為1∶4 000)，室溫孵育2 h，連續(xù)3次洗膜。向NC膜滴加ECL(300 μL)顯色液，顯影檢測，掃描條帶，然后用ImageJ對各條帶的灰度值進行計算。

2.5VSMCs內(nèi)鈣離子濃度的測定 Fluo-4/AM(3 μmol/L)標記大鼠主動脈VSMCs內(nèi)Ca2+，激光共聚焦顯微鏡檢測VSMCs內(nèi)Ca2+熒光強度的變化，以之間接反映VSMCs內(nèi)游離Ca2+濃度。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 原代大鼠主動脈VSMCs的培養(yǎng)及鑒定

大鼠胸主動脈組織塊培養(yǎng)1周后出現(xiàn)VSMCs，12 d后VSMCs匯合，見圖1A；經(jīng)α-SMA免疫組化染色后，可見胞質(zhì)呈棕色，見圖1B。

Figure 1. Primary culture and identification of rat aortic VSMCs (×100). A： primary culture of VSMCs; B: identification of VSMCs by immunocytochemical staining of α-SMA.

圖1大鼠主動脈血管平滑肌細胞的培養(yǎng)和鑒定

2 RT-qPCR篩選干擾效果

RT-qPCR結(jié)果顯示，與scrambled組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4組中Adra1d的mRNA表達差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，且shRNA4組的Adra1d mRNA表達量最低，見圖 2。因此，我們選擇shRNA4序列構(gòu)建載體，并包裝慢病毒。

Figure 2. The mRNA expression of Adra1d in 293T cells after transfection with 5 different shRNA plasmids. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled group.

圖25種不同的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后的Adra1dmRNA表達

3 慢病毒轉(zhuǎn)染后大鼠主動脈VSMCs內(nèi)Adra1d的mRNA和蛋白表達

與scrambled組比較，轉(zhuǎn)染后VSMCs的Adra1d mRNA和蛋白表達量均顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The expression of Adra1d at mRNA and protein levels in the VSMCs after Lv-shRNA4-Adr transfection. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsscrambled group.

圖3Lv-shRNA4-Adr轉(zhuǎn)染大鼠主動脈VSMCs后Adra1d的mRNA和蛋白表達

4 大鼠主動脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度的變化

Adra1d基因靶向沉默后，VSMCs的Ca2+熒光強度顯著高于scrambled組(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The changes of [Ca2+]iintensity in rat aortic VSMCs (×100). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsscrambled group.

圖4大鼠主動脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度的變化

5 慢病毒轉(zhuǎn)染后CaM表達量的變化

對比正常大鼠主動脈VSMCs，Adra1d基因靶向沉默后， VSMCs中CaM的mRNA和蛋白表達量均顯著增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The expression of CaM in the rat aortic VSMCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled group.

圖5大鼠主動脈血管平滑肌細胞CaM的mRNA和蛋白表達

討 論

VSMCs通過調(diào)控多種收縮蛋白、離子通道和信號分子而調(diào)節(jié)血管的舒縮活動。α1D-AR存在于細胞膜上，可調(diào)控收縮舒張信號通路。α1D-AR的升壓作用可能與它促進細胞收縮有關[13]，在苯腎上腺素導致VSMCs收縮的過程中，VSMCs的收縮速度與α1-AR的各亞型分布有關[14]，α1-AR各亞型可能通過影響交感神經(jīng)調(diào)節(jié)血壓的頻率和振幅從而調(diào)節(jié)血壓。相關研究表明，在兒茶酚胺所引起的升壓作用中，約有70%的作用是由α1D-AR引起的[14]，α1D-AR在大動脈收縮過程中發(fā)揮重要作用[15]。α1D-AR不僅可以直接調(diào)控血管收縮[16]，還可能通過調(diào)節(jié)其它亞型α1-AR的表達量從而發(fā)揮作用[17]?？梢?，Adra1d基因與血壓升高過程密切相關，該基因?qū)Ω哐獕河袧撛诘闹委熥饔?，因此，?gòu)建Adra1d基因的shRNA慢病毒載體有重要意義。

本實驗結(jié)果顯示，慢病毒介導轉(zhuǎn)染Adra1d基因shRNA可增加大鼠主動脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度，Adra1d基因被靶向沉默后，大鼠主動脈VSMCs的Ca2+熒光強度顯著高于scrambled組。而且與scrambled組相比較，轉(zhuǎn)染Adra1d基因shRNA的大鼠主動脈VSMCs中的CaM mRNA和蛋白表達量均顯著增加,而Ca2+和CaM作為細胞收縮過程中的關鍵因子和蛋白，其濃度增加之后，均可引發(fā)VSMCs發(fā)生收縮。

Sun等[6]針對Adra1d基因設計合成了siRNA，將siRNA導入大鼠VSMCs中，發(fā)現(xiàn)Adra1d基因的蛋白表達量顯著下降。本實驗結(jié)果顯示，慢病毒介導轉(zhuǎn)染Adra1d基因shRNA可顯著降低大鼠VSMCs內(nèi)Adra1d的mRNA和蛋白表達量?；贏dra1d基因與血壓升高過程密切相關，所以本次研究結(jié)果將對指導臨床高血壓的治療，尋找新的治療靶點有重要意義。