楊 毅， 官俏兵， 郭 麗， 韓晨陽(yáng)

(嘉興市第二醫(yī)院， 浙江 嘉興 314001)

Th22細(xì)胞亞群是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)CD4+T細(xì)胞亞群，Th22細(xì)胞在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著重要的作用[1]，有研究表明Th22細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素22(interleukin-22, IL-22)在多數(shù)腫瘤組織中存在高表達(dá)，而IL-22在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中的高表達(dá)是通過(guò)STAT3信號(hào)介導(dǎo)的[2]。IL-1β作為一種炎癥因子，目前研究主要集中在NLRP3小體的活化，也有文獻(xiàn)報(bào)道IL-1β可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，其作用與免疫抑制有關(guān)[3]。雖然IL-22和IL-1β在腫瘤組織中都存在高表達(dá)，但是鮮有二者關(guān)系的報(bào)道，而且Th22細(xì)胞分化激活的作用機(jī)制尚不明確。本文主要研究IL-1β誘導(dǎo)na?ve T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化的機(jī)制，并探討其在非小細(xì)胞肺癌患者外周血中表達(dá)的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 病例與材料

1.1病例的選擇 選擇2016年1月～2017年7月我院收治的非小細(xì)胞肺癌患者60人和健康志愿者25人。非小細(xì)胞肺癌患者中I期18人，II期20人，III期13人，IV期9人，男性38人，女性22人，年齡55～78歲，平均(64.2±5.4)歲；健康志愿者中男性16人，女性9人，年齡52～73歲，平均(62.2±3.8)歲。本研究符合倫理規(guī)范，試驗(yàn)對(duì)象均知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 FITC標(biāo)記的抗人CD4、PE標(biāo)記的抗人IL-22、PE標(biāo)記的抗人CD3、PerCP標(biāo)記的抗人CD44和APC標(biāo)記的抗人CD62L抗體(eBioscience)；IL-22的ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司); 重組人IL-1β和重組人IL-2(武漢艾美捷科技有限公司);TGF-β(R&D);培養(yǎng)基(武漢普諾賽生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1標(biāo)本的采集 所有受試者在禁食12 h后于次日清晨空腹采血于肝素抗凝管，將全血分為2份，其中1份用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，另一份血樣離心后將血清分離，用于進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。健康志愿者全血分離血清后，取血細(xì)胞進(jìn)行na?ve T細(xì)胞的提取。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞 24孔板中每孔加入PBMC 2×106個(gè)左右，每孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基1 mL后培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞于EP管，離心后用PBS洗2次，加入PBS 100 μL重懸后，加入FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體，避光孵育30 min，離心后去掉上清， PBS洗2次，加入PE標(biāo)記的抗人IL-22抗體，避光30 min后，PBS洗2次，250 μL PBS重懸后檢測(cè)，標(biāo)本均做同型對(duì)照，結(jié)果以CD4+IL-22+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3ELISA法檢測(cè)血清IL-22和IL-1β的含量 按照ELISA試劑盒操作。

2.4Na?ve T細(xì)胞的分選和鑒定 健康人的全血細(xì)胞分離得到PBMC后，采用人CD4+na?ve T細(xì)胞磁珠分選試劑盒進(jìn)行PBMC中CD4+na?ve T細(xì)胞的分選。分離得到的na?ve T細(xì)胞加入PE標(biāo)記的抗人CD3、FITC標(biāo)記的抗人CD4、PerCP標(biāo)記的抗人CD44和APC標(biāo)記的抗人CD62L抗體，利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD3+CD4+CD44-CD62L+細(xì)胞(即CD4+na?ve T細(xì)胞)的比例。

2.5IL-1β誘導(dǎo)Na?ve T細(xì)胞的分化 將分離得到的na?ve T細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組(TGF-β+IL-2)、實(shí)驗(yàn)組(TGF-β+IL-2+IL-1β)和陰性對(duì)照組(抗人IL-1β抗體+TGF-β+IL-2+IL-1β)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞數(shù)為2×105，其中IL-1β的終濃度為100 μg/L，抗人IL-1β抗體的濃度為100 μg/L，誘導(dǎo)24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-22+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例。

2.6培養(yǎng)基中IL-22的測(cè)定 收集上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)基按照ELISA試劑盒操作測(cè)定培養(yǎng)基中IL-22的水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Na?ve T細(xì)胞分選結(jié)果

通過(guò)磁珠分選后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示分離得到的CD3+CD4+CD44-CD62L+T細(xì)胞的比例為93.8%，純度較高，可以用于誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

2 IL-1β誘導(dǎo)na?ve T細(xì)胞的分化

經(jīng)過(guò)24 h的誘導(dǎo)后，對(duì)照組細(xì)胞中CD4+IL-22+T細(xì)胞的比例為(0.32±0.05)%，而實(shí)驗(yàn)組中CD4+IL-22+T細(xì)胞的比例為(35.32±4.21)%，陰性對(duì)照組中CD4+IL-22+T細(xì)胞的比例為(19.53±5.14)%，結(jié)果表明IL-1β可以誘導(dǎo)na?ve T細(xì)胞向Th22分化，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及陰性對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 IL-1β誘導(dǎo)na?ve T細(xì)胞的分化后培養(yǎng)基中IL-22的含量變化

Figure 1. The proportion of na?ve T cells after separation from magnetic beads.

圖1磁珠分選后na?veT細(xì)胞的比例

Figure 2. The proportion of Th22 cells after IL-1β induction. A: control group; B: experimental group; C: negative control group.

圖2IL-1β誘導(dǎo)分化后Th22細(xì)胞的比例

對(duì)照組培養(yǎng)基中IL-22的含量為(832.25±212.30) ng/L，實(shí)驗(yàn)組中IL-22的含量為(3 685.32±189.62) ng/L，陰性對(duì)照組中IL-22的含量為(1 657.35±234.30) ng/L,實(shí)驗(yàn)組中IL-22的含量明顯高于對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明IL-1β誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化的同時(shí)還可以促進(jìn)IL-22的分泌。

4 非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞比例的變化

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

5 非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞的比例與臨床分期的關(guān)系

通過(guò)統(tǒng)計(jì)，I期患者Th22細(xì)胞的比例為(0.92±0.15)%，II期為(1.35±0.54)%，III期為(1.74±0.85)%，IV期為(1.98±0.68)%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

6 外周血中IL-1β表達(dá)與Th22細(xì)胞比例的相關(guān)性

將外周血中Th22細(xì)胞所占比例和IL-1β含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示IL-1β含量和Th22細(xì)胞比例密切相關(guān)(r=0.843，P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 3. The proportion of Th22 cells in peripheral blood of the patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).

圖3非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞的比例

7 外周血中IL-22表達(dá)與臨床分期的關(guān)系

I期患者外周血IL-22的含量為(11.57±1.58) ng/L，II期為(13.42±0.98) ng/L，III期為(15.35±1.19) ng/L，IV期為(20.23±0.90) ng/L，較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 4. The relationship between the proportion of Th22 cells in the peripheral blood and the the clinical stage of the non-small cell lung cancer patients.

圖4外周血中Th22細(xì)胞比例與臨床分期的關(guān)系

Figure 5. The correlation between the expression of IL-1β and the proportion of Th22 cells in peripheral blood.

圖5外周血中IL-1β表達(dá)與Th22細(xì)胞比例的相關(guān)性

Figure 6. The relationship between the expression of IL-22 and the clinical stage. Mean±SD.

圖6IL-22表達(dá)與臨床分期的關(guān)系

討 論

輔助性T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中重要的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞，根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子不同可以分為T(mén)h1、Th2、Th9、Th7和Th22等亞群。Th22細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)輔助性T細(xì)胞，目前認(rèn)為其參與了機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。Th22細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞的亞群，能高水平表達(dá)IL-22和干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)。在漿細(xì)胞樣免疫細(xì)胞的刺激下，TNF-α和IL-6等可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化，而CCR6等趨化因子也可以反饋促進(jìn)Th22細(xì)胞的分化[4-6]。在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，CD4+細(xì)胞受到腫瘤微環(huán)境的控制，可以在微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)分化，IL-22是Th22細(xì)胞的最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，與Th22細(xì)胞組成共同效應(yīng)的整體，Wang等[7]的研究發(fā)現(xiàn)IL-22可以促進(jìn)肝臟腫瘤和肝癌的易感性；Jiang等[8]和Zhuang等[9]發(fā)現(xiàn)IL-22在人類(lèi)原發(fā)性肝癌浸潤(rùn)組織中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中存在高表達(dá)，且與分期有關(guān)；Park等[10]發(fā)現(xiàn)，IL-22轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟IL-22上調(diào)可以促進(jìn)肝炎向肝癌轉(zhuǎn)化；Ye等[11]發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞在惡性胸腔積液中的比例顯著高于外周血，其作用可能與CCR6有關(guān)；Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者中，腫瘤組織及胸腔積液可以檢測(cè)出高水平的IL-22，腫瘤通過(guò)自分泌方式分泌IL-22提高了腫瘤細(xì)胞抗凋亡的作用。IL-1β的主要功能是促進(jìn)內(nèi)源性的致熱源參與炎癥反應(yīng)，幾乎有核的細(xì)胞都可以表達(dá)IL-1β。IL-1β可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，活化趨化因子、環(huán)氧化酶等炎癥因子的表達(dá)，參與腫瘤惡液質(zhì)的產(chǎn)生等。現(xiàn)有研究表明，在腫瘤組織中存在較高水平的IL-1β與多種輔助性T細(xì)胞，IL-1β可以促進(jìn)Th9細(xì)胞的增殖并參與腫瘤組織的免疫抑制[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22和IL-1β的水平較高，且IL-1β與Th22細(xì)胞比例存在高度的相關(guān)性，所以我們分離人外周血中na?ve T細(xì)胞，進(jìn)行體外IL-1β刺激，結(jié)果顯示體外IL-1β可以促進(jìn)na?ve T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化，而非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞比例和IL-22表達(dá)相比正常人增高，且Th22細(xì)胞比例和IL-22表達(dá)與臨床分期相關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)存在一致性，表明Th22細(xì)胞的分化和激活與IL-1β有關(guān)，推測(cè)二者共同作用調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可以促進(jìn)na?ve T細(xì)胞向Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)化且促進(jìn)關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-22的表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌患者外周血中Th22細(xì)胞比例和IL-1β水平存在高度相關(guān)性，Th22細(xì)胞比例和IL-22水平與臨床分期相關(guān)，三者可以作為非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展及預(yù)后的參考指標(biāo)，但是Th22細(xì)胞對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的作用還有待進(jìn)一步研究。