張 華， 周光群

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科, 2內(nèi)鏡科， 貴州 遵義 563000)

隨著人們生活水平的提高，酒精消費(fèi)在人群中逐年升高，因此酒精所誘發(fā)的疾病亦日益增長。長期大量飲酒可導(dǎo)致肝細(xì)胞損害、脂質(zhì)過氧化及肝纖維化，繼而進(jìn)展為肝硬化。在我國，因長期大量飲酒導(dǎo)致的慢性肝病發(fā)生率呈明顯上升趨勢，已成為影響人類健康的隱形殺手。因此，對酒精性肝病的防治具有重大的臨床意義。紅景天為多年生草本植物，主要生長在海拔1 600～4 000米的高寒、缺氧、晝夜溫差大的地區(qū)，屬于益氣活血類中藥。紅景天甙(salidroside)為紅景天主要有效成分，研究表明，紅景天甙有調(diào)節(jié)免疫、抗凋亡、抗纖維化、抗輻射及清除自由基等作用[1-4]，但紅景天甙對酒精性肝損傷是否具有藥效，報(bào)道甚少。因此，本文采用56%乙醇灌胃誘導(dǎo)酒精性肝損傷模型，觀察紅景天甙對酒精性肝損傷大鼠血清甘油三酯(triacylglycerol，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平及肝組織病理學(xué)變化的影響，探討其護(hù)肝作用及其可能機(jī)制，為紅景天甙的臨床藥用提供有效證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物與試劑

100只SD雄性大鼠，體重200～230 g，購自華西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB) ELISA試劑盒購自Biosource；兔抗鼠TNF-α和NF-κB抗體及兔抗鼠β-actin抗體購自Bioworld；TRIzol試劑盒購自北京天根；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；RT-PCR引物由上海生工合成；紅景天甙粉劑購自云南同持生物技術(shù)公司；聯(lián)苯雙酯(bifendate)滴丸購自浙江醫(yī)藥股份有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1動物模型的制作 100只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組(n=20):空白對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸(200 mg/kg)陽性對照組及紅景天甙低劑量和高劑量組，每組大鼠灌胃給藥，除空白組給予生理鹽水外，其余各組均給予56%乙醇灌胃，每天08:00給予56%乙醇灌胃1次，乙醇開始劑量為第 1 周10 mL/kg，以后每周遞增1 mL，持續(xù)灌胃4周，大鼠造模的同時(shí)給予藥物治療，每天13:00陽性對照組給予聯(lián)苯雙酯滴丸1次，紅景天甙組給予紅景天甙滅菌水溶液(20 mg/kg、40 mg/kg，濃度8 g/L)1次，空白組及模型組均給予生理鹽水，灌胃體積為10 mL/kg。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束即第4周末，大鼠隔夜禁食12 h后麻醉狀態(tài)下心臟取血，分離血清，迅速解剖取出肝臟，剪取肝組織200 g制備組織勻漿，另取同一肝葉、同一位置、大小約0.5 cm×0.5 cm的肝組織，以40 g/L 多聚甲醛固定，部分肝組織-80 ℃冰箱保存。

2.2指標(biāo)測定 (1)造模過程中觀察各組大鼠的體質(zhì)量和精神狀態(tài)等。(2)HE染色制作切片，光鏡下觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化。(3)全自動血清生化儀檢測血清中TG、ALT和AST水平。(4)按試劑盒測定方法檢測MDA含量及SOD活性。(5)ELISA法檢測血清TNF-α和NF-κB含量，具體方法按說明書進(jìn)行。(6) Western blot法測定TNF-α和NF-κB的蛋白表達(dá)：取出肝組織制備蛋白樣品，Bradford比色法測定蛋白濃度，取蛋白20 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉1 h，經(jīng)電泳、抗體結(jié)合免疫，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像,進(jìn)行蛋白條帶的灰度值測定，反映蛋白表達(dá)(以β-actin作為內(nèi)參照)。(7) RT-PCR測定TNF-α和NF-κB 的mRNA表達(dá)水平：參照TRIzol試劑盒說明書提取RNA后，采用RT-PCR半定量法檢測mRNA含量，以β-actin為內(nèi)參照。β-actin上游引物序列為5’-CTATCCTTCTTCGCAT-3’，下游引物序列為5’-TAATTGTCGCAGATCG-3’，產(chǎn)物為960 bp；TNF-α的上游引物序列為5’-TCAAAACTCGAGTGACA-3’，下游引物序列為5’-AGTGGGTTCTGTCTGAGCC-3’，產(chǎn)物為200 bp；NF-κB的上游引物序列為5’-GAGGTCCAGAGGGAAGT-3’，下游引物序列為5’-CACCGGTAACAAAGGCC-3’，產(chǎn)物為350 bp。PCR按照20 μL反應(yīng)體系加入引物和試劑，最后加入Taq酶，各擴(kuò)增管放置于PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件：94 ℃變性40 s、退火45 s(退火溫度分別為60 ℃、55 ℃和54 ℃)、72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中測定目的基因與β-actin的吸光度比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)檢驗(yàn)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況的變化

在造模過程中，空白對照組大鼠飲食攝入規(guī)律，皮毛色澤光亮，精神狀態(tài)佳，體重有所增加；模型組大鼠在每日乙醇灌胃后先出現(xiàn)精神亢進(jìn)、興奮，持續(xù)2 h后出現(xiàn)精神萎靡，持續(xù)2周左右，大鼠皮毛色澤變暗、干枯，精神狀態(tài)差，飲食減少，體重增加變緩，部分甚至出現(xiàn)體重下降；紅景天甙低劑量及高劑量給藥組大鼠一般情況均優(yōu)于模型組。

2 大鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

空白組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞胞漿疏松化，胞漿內(nèi)可見脂肪空泡變，肝竇明顯擴(kuò)張，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，部分肝小葉內(nèi)纖維組織增多，肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀及灶性壞死；紅景天甙40 mg/kg給藥組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)比較規(guī)整，肝細(xì)胞水腫及胞漿疏松化明顯減輕，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤減少，未見壞死肝細(xì)胞；紅景天甙20 mg/kg 給藥組可見肝小葉結(jié)構(gòu)輕微紊亂，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。紅景天甙組大鼠肝細(xì)胞病變程度較模型組明顯減輕，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of the liver tissues with HE staining (×200).

圖1各組大鼠肝臟病理學(xué)變化

3 各組大鼠血清指標(biāo)比較

模型組的TG、ALT及AST水平均明顯高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，紅景天甙高、低劑量組的TG、ALT和AST水平均顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清TG、ALT及AST水平的變化

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmodel group.

4 各組大鼠肝組織MDA含量及SOD活性的比較

模型組MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.05)，紅景天甙高、低劑量組肝組織勻漿中MDA含量均明顯低于模型組(P<0.05)；模型組SOD活性明顯低于空白對照組(P<0.05)，紅景天甙高、低劑量組肝組織勻漿中SOD活性均明顯高于模型組(P<0.05)，見表2。

5 各組大鼠血清TNF-α和NF-κB 含量的變化

模型組TNF-α和NF-κB 含量明顯高于空白對照組(P<0.05)；紅景天甙高、低劑量組血清中TNF-α和NF-κB 含量均明顯低于模型組(P<0.05)，見表3。

表2各組大鼠肝組織MDA含量及SOD活性的變化

Table 2. The effect of salidroside on the content of MDA and activity of SOD in rat liver tissues (Mean±SD.n=20)

GroupMDA(μmol/gprotein)SOD(×103U/gprotein) Control0．81±0．16214．85±60．21 Bifendate0．87±0．44196．96±60．28 Model1．86±0．14?114．98±65．28? High?dosesalidroside0．86±0．14△200．38±76．02△ Low?dosesalidroside0．91±0．12△186．38±54．02△

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmodel group.

表3各組大鼠血清TNFα和NF-κB含量的變化

Table 3. The effect of salidroside on the serum levels of TNF-α and NF-κB in rats (Mean±SD.n=20)

GroupTNF?α(ng/L)NF?κB(ng/L) Control112．81±15．16140．46±12．22 Bifendate128．57±18．24154．53±14．27 Model158．46±20．14?196．78±16．23? High?dosesalidroside116．67±18．13△152．50±15．19△ Low?dosesalidroside126．91±16．12△164．54±13．18△

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmodel group.

6 Western blot結(jié)果

對照組TNF-α和NF-κB 蛋白呈低表達(dá)；模型組TNF-α和NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)；紅景天甙高、低劑量組及陽性藥物對照組TNF-α和NF-κB蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)，見圖2、表4。

7 RT-PCR結(jié)果

對照組TNF-α和NF-κB mRNA呈低表達(dá)；模型組TNF-α和NF-κB的mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)；紅景天甙高、低劑量組及陽性藥物對照組TNF-α和NF-κB的mRNA表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)，高劑量紅景天甙組最為顯著，見圖3、表5。

Figure 2. The protein expression of TNF-α and NF-κB in rat liver tissues detected by Western blot.

圖2各組大鼠肝組織TNF-α及NF-κB的蛋白表達(dá)情況

表4各組大鼠肝組織TNF-α和NF-κB的蛋白表達(dá)

Table 4. The protein expression of TNF-α and NF-κB in rat liver tissues detected by Western blot (Mean±SD.n=20)

GroupTNF?αNF?κB Control0．10±0．010．15±0．02 Model0．51±0．04?0．74±0．06? Bifendate0．39±0．040．41±0．05 High?dosesalidroside0．18±0．02△0．32±0．01△ Low?dosesalidroside0．26±0．03△0．36±0．03△

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmodel group.

Figure 3. The mRNA expression of TNF-α和NF-κB in rat liver tissues detected by RT-PCR.

圖3各組大鼠肝組織TNF-α及NF-κB的mRNA表達(dá)情況

討 論

酒精性肝病(alcoholic liver diseases)是由于長期大量飲酒后乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛引起的肝臟內(nèi)環(huán)境及代謝紊亂的慢性肝病。疾病初期表現(xiàn)為脂肪肝，隨著病程進(jìn)展可發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化，部分可發(fā)展至肝癌[5]。隨著人們生活水平的提高，酒精消費(fèi)人群在我國逐年上升，因酒精所誘發(fā)的疾病呈年輕化趨勢。因此，酒精性肝病的防治成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，乙醇在肝細(xì)胞微粒體代謝過程中產(chǎn)生大量乙醛，乙醛具有明顯的細(xì)胞毒性作用，這種毒性作用可以抑制SOD抗氧化功能，從而使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高，氧自由基大量蓄積導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)[6]，同時(shí)乙醛影響大鼠肝組織脂質(zhì)代謝，使脂肪酸氧化減弱和三羧酸循環(huán)障礙，導(dǎo)致高脂血癥和脂肪肝[7]。

表5各組大鼠肝組織TNF-α和NF-κB的mRNA表達(dá)

Table 5. The mRNA expression of TNF-α and NF-κB in rat liver tissues detected by RT-PCR (Mean±SD.n=20)

GroupTNF?α/β?actinNF?κB/β?actin Control0．46±0．130．40±0．16 Model1．66±0．12?1．72±0．13? Bifendate0．67±0．240．62±0．26 High?dosesalidroside0．58±0．16△0．52±0．16△ Low?dosesalidroside0．62±0．14△0．54±0．14△

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmodel group.

乙醇灌胃為誘導(dǎo)酒精性肝損傷動物模型的常用方法[8]，本實(shí)驗(yàn)通過乙醇灌胃誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型，進(jìn)一步探討紅景天甙的護(hù)肝作用及機(jī)制。灌胃乙醇4周后病理結(jié)果提示肝細(xì)胞不同程度受損，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞脂肪變性、凋亡及壞死，血清ALT和AST活性顯著升高，AST水平高于ALT，肝勻漿中MDA含量升高且SOD活力降低，肝臟出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，表明本實(shí)驗(yàn)動物模型成功制備。

正常情況下，血清中ALT和AST含量甚少，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，存在于肝細(xì)胞胞漿及線粒體中的轉(zhuǎn)氨酶就會顯著升高并釋放到血液中，血清轉(zhuǎn)氨酶水平是肝臟損傷的敏感指標(biāo)，其活性升高一定程度可反映肝臟受損傷的程度[9]。本研究表明紅景天甙各劑量組大鼠血清ALT及AST水平顯著降低，表明，紅景天甙具有一定的護(hù)肝作用。

在生理情況下，體內(nèi)氧自由基生成與清除保持一定的平衡。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，是機(jī)體抗氧化平衡的重要指標(biāo)。當(dāng)體內(nèi)生成大量氧自由基時(shí)，其攻擊細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸，從而使脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量升高，MDA可與生物分子結(jié)合形成復(fù)合物破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定，是細(xì)胞氧化損傷的重要指標(biāo)。長期慢性肝臟酒精代謝造成肝細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致肝臟血脂代謝異常，血清中TG含量升高。因此血清中TG水平的變化也可間接反映酒精性肝損傷的程度[10]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組抗氧化酶SOD活力下降，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量升高，血清TG含量升高，表明酒精引起肝損傷與體內(nèi)氧化與抗氧化失衡有關(guān)。紅景天甙各劑量組結(jié)果表明，紅景天甙能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化清除氧自由基的能力，使肝臟脂代謝穩(wěn)定，防止過度脂質(zhì)過氧化，紅景天甙高劑量組修復(fù)作用最為顯著，且HE染色結(jié)果同時(shí)證實(shí)，紅景天甙治療組與模型組相比，肝細(xì)胞形態(tài)及肝小葉結(jié)構(gòu)均得到改善，與陽性對照藥聯(lián)苯雙酯滴丸療效相近，說明紅景天甙具有護(hù)肝作用。

研究表明，激活的 Kupffer 細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-6、IL-1β及TNF-α 等與酒精性肝損傷及其損傷程度高度相關(guān)[11-12]。NF-κB信號通路是介導(dǎo)各種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的重要途徑之一。為了進(jìn)一步研究紅景天甙護(hù)肝作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法測定各組大鼠血清中TNF-α和NF-κB的含量，Western blot 測定肝組織TNF-α和NF-κB的蛋白表達(dá)變化， RT-PCR測定其mRNA表達(dá)變化。酒精可激活Kupffer 細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，其中TNF-α 是肝臟炎癥反應(yīng)重要的細(xì)胞因子。在生理情況下TNF-α具有促進(jìn)肝臟再生的功能，但是在酒精性肝損傷的發(fā)病過程中TNF-α的保護(hù)功能被逆轉(zhuǎn)，反而加重肝臟損傷[13]。TNF-α 可活化NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞凋亡及免疫介導(dǎo)等方面發(fā)揮作用[14]。在生理狀態(tài)，NF-κB與抑制性IκB結(jié)合，呈二聚體形式，處于失活狀態(tài)；在病理狀態(tài)下，NF-κB活化后與IκB解離，并進(jìn)入細(xì)胞核中，與特定的靶基因結(jié)合調(diào)控相應(yīng)的炎癥因子，增強(qiáng)TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄，炎癥反應(yīng)逐級放大。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組TNF-α及NF-κB含量均明顯升高，給予不同劑量紅景天甙處理后，炎癥指標(biāo)明顯下降，炎癥反應(yīng)減輕。

通過上述研究得出，紅景天甙能夠改善酒精性肝損傷的病理學(xué)改變，一方面降低肝酶學(xué)指標(biāo)，提高抗氧化酶SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA產(chǎn)生；另一方面降低炎癥因子TNF-α及NF-κB含量表達(dá)，減輕肝臟損傷程度。因此，紅景天甙可能通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少活性氧自由基生成，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)達(dá)到保護(hù)肝臟的功能。