郝廣婧，祁銀燕，朱春云

（青海大學(xué)a.青海省農(nóng)林科學(xué)院；b.青海高原林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室；c.三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

青海省柴達(dá)木盆地是我國(guó)枸杞原生地之一。盆地具有獨(dú)特的自然環(huán)境和高原氣候，孕育出珍稀植物資源——黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.。盆地晝夜溫差大，日照時(shí)間長(zhǎng)，充足的光照環(huán)境誘導(dǎo)黑果枸杞在其漿果內(nèi)積累了花青素、多糖、多酚、維生素和礦物質(zhì)各種營(yíng)養(yǎng)成分，尤其含有能清除自由基、具有抗氧化功能的花青素[1]。

黑果枸杞是重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種[2]。成熟的黑果枸杞果實(shí)中富含花青素，有關(guān)藥理學(xué)的研究結(jié)果表明，這種黃酮類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化能力[3-5]，能夠延緩衰老，同時(shí)能夠預(yù)防心血管疾病[6-7]、肥胖和糖尿病[6]；其果實(shí)中含有的多酚具有提高免疫力，調(diào)控人的情緒、促進(jìn)人體腸道健康等功效[8]；多糖具有一定的抗氧化活性[9]，有降血糖和抗疲勞功能[10]。曾琳娜[11]研究提出，香茹多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒感染等功能。白鵬威[12]等人的研究結(jié)果也表明，果實(shí)的糖代謝和糖積累不僅與相關(guān)酶活性有關(guān)，也受遺傳因子、植物激素、生態(tài)因子的調(diào)控和影響。外在環(huán)境通過影響黑果枸杞果實(shí)內(nèi)相關(guān)代謝合成酶的活性來影響其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝和積累，而且在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期其不同部位的酶活性不同。光是一個(gè)很重要的環(huán)境因子，調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和新陳代謝[13-14]，是植物合成有機(jī)物的能源[15]，光照強(qiáng)度的大小可以直接影響到植物生長(zhǎng)和活性成分的積累[16]。為了探究光照對(duì)黑果枸杞果實(shí)中主要活性成分含量的影響情況，以柴達(dá)木盆地的黑枸杞果實(shí)為研究材料，在其果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期對(duì)其分別進(jìn)行了光處理與暗處理，分析了光照對(duì)黑果枸杞果實(shí)中主要活性成分含量的影響情況。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的植物材料為青海省柴達(dá)木盆地人工種植的黑果枸杞。

主要儀器設(shè)備：電子天平（BSA224S-CW）、電熱鼓風(fēng)干燥箱[DHG-9070(A) (101-1)]、紫外可見光光度計(jì)（N4S）、低溫離心機(jī)（5810R，Eppendorf）、渦旋振蕩器（XH-D，Thermo）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究按黑果枸杞果實(shí)發(fā)育過程和顏色變化，將果實(shí)從幼果期到成熟期的整個(gè)發(fā)育時(shí)期劃分為5個(gè)時(shí)期（Stage）分別命名為S1、S2、S3、S4和S5（S-sample）：S1，果實(shí)為青綠色；S2，果實(shí)開始轉(zhuǎn)色，明顯附著紫色；S3，果實(shí)完全著紫色，開始膨大，硬度變小；S4，果實(shí)紫黑色，正在膨大；S5，果實(shí)黑色，完全膨大。本研究共設(shè)光處理與暗處理2個(gè)因素5個(gè)水平的兩兩對(duì)比處理。光處理：正常自然光照條件；暗處理：利用遮光袋模擬黑暗環(huán)境進(jìn)行處理。分別對(duì)每個(gè)發(fā)育時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行套袋遮光處理，以正常光照條件下生長(zhǎng)的黑果枸杞果實(shí)為對(duì)照，遮光處理10 d后分別測(cè)定果實(shí)內(nèi)花青素、多糖及多酚的含量。

1.3 樣品的處理與采集

1.3.1 樣品的處理

為了研究光照對(duì)黑果枸杞果實(shí)表型形態(tài)和果實(shí)內(nèi)主要活性成分的影響程度，我們分別采集了果實(shí)發(fā)育5個(gè)時(shí)期（S1—S5）遮光處理和自然光照條件（對(duì)照組）下生長(zhǎng)的漿果進(jìn)行研究，其中，L1～L5為5個(gè)時(shí)期自然光照條件下生長(zhǎng)的漿果；D1～D5為5個(gè)時(shí)期遮光處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)的漿果，共采集了10組果實(shí)樣品，各組果實(shí)樣品的采集時(shí)間分別見表1。

表1 不同處理果實(shí)樣品的采集時(shí)間Table 1 Collection time of different processed fruit samples

1.3.2 樣品的采集

用剪刀分別剪下2個(gè)處理下5個(gè)時(shí)期的果實(shí)（帶果柄），采集時(shí)戴好手套，避免用手直接接觸果實(shí)，采摘后用錫紙包裹后置于液氮中冷凍，存于-80 ℃的冰柜中以備用。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與測(cè)定方法

1.4.1 花青素的測(cè)定

參考并改進(jìn)汪洋、孫建霞等人有關(guān)花青素的提取方法[17-18]，準(zhǔn)確稱取0.1 g黑果枸杞干粉，加入1% HCL/CH3OH（v/v）的混合液5 mL，于4 ℃條件下黑暗浸提24 h。然后，將混合液以4 ℃/10 000 r離心30 min，冷凍離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的10 mL離心管中，向剩余沉淀物中再加入1% HCL/CH3OH（v/v）的混合液2 mL，重懸后于4 ℃條件下黑暗浸提24 h并離心。合并上清液，定容至10 mL，充分振蕩后得到樣品溶液。利用紫外可見光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)530 nm處[19]測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定值取3次技術(shù)重復(fù)的（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

1.4.2 多糖的測(cè)定

參考并改進(jìn)劉曉涵等人[20]的苯酚硫酸法測(cè)定多糖。準(zhǔn)確稱取0.1 g黑果枸杞干粉加入80%乙醇溶液5 mL，于60 ℃下水浴30 min，充分振蕩后將混合液以4 ℃/10 000 r離心30 min，冷凍離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到25 mL的離心管中，將濾渣用相同提取工藝提取至濾液無(wú)表色，重復(fù)浸提2～3次后合并濾液定容。吸取2 mL置于10 mL的離心管中，在沸水浴中蒸干，準(zhǔn)確加入10 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢枋固侨芙?。? ℃/3 500 r離心5 min，取1 mL上清液稀釋50倍。精密加入5%苯酚溶液，搖勻后迅速加入硫酸5 mL，搖勻后常溫下放置10 min，置于40 ℃水浴中保溫20 min，取出后迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白。以紫外-可見光分光光度法，在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定值取3次技術(shù)重復(fù)的（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

1.4.3 多酚的測(cè)定

參考GB/T8313-2008[21]中的茶多酚測(cè)定方法并加以改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取0.1 g黑果枸杞干粉加入50%的CH3OH溶液10 mL，震蕩提取30 min。用超聲波提取40 min，4 ℃/9 000 r離心15 min。濾渣用相同提取工藝提取至濾液無(wú)表色。合并濾液定容至50 mL的容量瓶中，取1 mL提取液稀釋10倍，依次加入蒸餾水5.0 mL、10%的Filin-Ciocalteu試劑5 mL。充分震蕩后靜置3 min后，加入7.5%的Na2CO3溶液4.0 mL，搖勻，于35 ℃下恒溫水浴1.5 h。顯色后利用紫外可見光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定并計(jì)算。試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定值取3次技術(shù)重復(fù)的（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

2 結(jié)果與分析

利用SPSS 18.0對(duì)黑果枸杞主要活性成分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2.1 果實(shí)表型形態(tài)分析

果實(shí)的色素種類和含量決定了果實(shí)顏色的多樣性。黑果枸杞在不同處理下各發(fā)育時(shí)期漿果的表型特征如圖1～4所示。從圖中可以看出，與對(duì)照組相比，在S1—S2時(shí)期遮光處理下的果實(shí)均有不同程度的褪色，且遮光處理下每個(gè)發(fā)育階段果實(shí)生長(zhǎng)都比較緩慢，但個(gè)體差異并不是十分明顯的。

圖1 自然光照下不同發(fā)育時(shí)期的漿果（正面）Fig. 1 Different developmental stages under the light(positive)

圖2 遮光處理下不同發(fā)育時(shí)期的漿果（正面）Fig. 2 Different developmental stages under the dark (positive)

圖3 自然光照下不同發(fā)育時(shí)期的漿果（立面）Fig. 3 Different developmental stages under the light (fa?ade)

圖4 遮光處理下不同發(fā)育時(shí)期的漿果（立面）Fig. 4 Different developmental stages under the dark (fa?ade)

2.2 花青素含量分析

采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定2個(gè)處理下黑果枸杞5個(gè)不同發(fā)育階段果實(shí)中花青素的含量，結(jié)果如表2。

表2 不同光照條件下黑果枸杞果實(shí)各生長(zhǎng)時(shí)期其花青素含量的測(cè)定結(jié)果?Table 2 Anthocyanidin contents of Lycium ruthenicum Murr. in different stages under different light conditions

由表2可知，光處理和暗處理下黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的花青素含量隨著果實(shí)的逐漸成熟均呈逐漸增加后減少的變化趨勢(shì)，從S1和S2這2個(gè)時(shí)期的測(cè)定結(jié)果可以看出，2個(gè)處理間存在差異，但差異不顯著；從S3、S4和S5此3個(gè)時(shí)期的測(cè)定結(jié)果可以看出，2個(gè)處理下果實(shí)內(nèi)的花青素含量均呈上升趨勢(shì)，且都在S5時(shí)期有所回落。但是，暗處理下果實(shí)內(nèi)花青素的含量會(huì)明顯低于光處理的果實(shí)，且光處理下黑果枸杞在S3時(shí)期果實(shí)內(nèi)的花青素含量就達(dá)到了5.02 mg·g-1，而此期暗處理下果實(shí)內(nèi)的花青素含量?jī)H有0.50 mg·g-1，存在極顯著差異。

從表2中的花青素含量可以看出，2個(gè)處理下黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的花青素含量均在S4時(shí)期最高，且暗處理下果實(shí)內(nèi)花青素的含量會(huì)略低于光處理，這一結(jié)果證明，光可能是影響花青素生物合成的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，這為后續(xù)有關(guān)光誘導(dǎo)花青素生物合成深層分子機(jī)制的揭示奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 多糖含量分析

采用苯酚硫酸法對(duì)光處理及暗處理下不同發(fā)育時(shí)期黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的多糖含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表3。由表3可得，隨著黑果枸杞果實(shí)的逐漸成熟果實(shí)內(nèi)的多糖含量逐漸增加，在S1時(shí)期2個(gè)處理下果實(shí)內(nèi)多糖含量間就存在顯著性差異，而從S2到S5時(shí)期2個(gè)處理下黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的多糖含量均一直呈極顯著差異，且在S3時(shí)期光處理下果實(shí)內(nèi)的多糖含量呈急速上升趨勢(shì)，而暗處理的果實(shí)在同一時(shí)期其多糖含量?jī)H有2.39 mg·g-1，直到S4時(shí)期才出現(xiàn)急速上升趨勢(shì)。因此，光照可能對(duì)黑果枸杞果實(shí)內(nèi)枸杞多糖的積累有明顯影響。

表3 不同光照條件下黑果枸杞果實(shí)各生長(zhǎng)時(shí)期其多糖含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Polysaccharides contents of Lycium ruthenicum Murr. in different stages under different light conditions

2.4 多酚含量分析

采用Folin-Ciocalteau法對(duì)光處理及暗處理下不同發(fā)育時(shí)期黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的多酚含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表4。由表4可得，光處理和暗處理下黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的多酚含量均隨果實(shí)發(fā)育而逐漸增加。在S4時(shí)期其多酚含量均很高，隨后在S5時(shí)期又有所緩減，且2個(gè)處理下果實(shí)發(fā)育時(shí)期的變化趨勢(shì)相似，不存在顯著性差異。光照對(duì)黑果枸杞果實(shí)內(nèi)多酚的積累可能沒有很顯著的影響，對(duì)此研究結(jié)果（即光照對(duì)植物多酚有無(wú)影響的問題）我們還將進(jìn)一步探討。

表4 不同光照條件下黑果枸杞果實(shí)各生長(zhǎng)時(shí)期其多酚含量的測(cè)定結(jié)果Table 4 Polyphenol contents of Lycium ruthenicum Murr.in different stages under different light conditions

3 結(jié)論與討論

青海省柴達(dá)木盆地的黑果枸杞果實(shí)內(nèi)含有豐富的花青素，這使得黑果枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于紅果枸杞。而花青素的合成與代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅與相關(guān)的酶活性有關(guān)，同時(shí)受植物發(fā)育階段和環(huán)境因素的調(diào)控[22]。目前，與植物發(fā)育和環(huán)境因素相關(guān)的花青素生物合成機(jī)制的影響因素仍不清楚。已有研究結(jié)果表明，光是影響花青素生物合成的關(guān)鍵環(huán)境因素之一[23]。在以前的許多研究中就提到花或果實(shí)中的花青素的積累是由強(qiáng)光誘導(dǎo)進(jìn)行的，相比之下，在弱光或黑暗條件下，相關(guān)基因的表達(dá)被下調(diào)或抑制，這導(dǎo)致花青素在花和果實(shí)中的積累減少，從而產(chǎn)生白色或淺色的器官[24-27]。黑果枸杞中的枸杞多糖含量同樣也很高，其主要成分為鼠李糖和阿拉伯半乳糖聚糖。近年來，由于多糖具有來源廣以及抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌多種活性功能的特點(diǎn)，所以有關(guān)枸杞多糖的研究已成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一[28]。黑果枸杞含有的多糖具有多種生物活性和很高的藥用價(jià)值。白鵬威等人[6]研究提出，在一定條件下光照的減弱會(huì)減少植物果實(shí)內(nèi)多糖的積累；殷培蕾等人研究發(fā)現(xiàn)，光照不僅影響植物中多酚的種類和生物量，還會(huì)改變其抗氧化活性[29]。由此可見，光照不足會(huì)引起光合作用減弱，致使果實(shí)變小，最終會(huì)導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)的減少和降低[30-32]。

本研究結(jié)果表明，遮光處理對(duì)黑果枸杞果實(shí)中花青素和枸杞多糖的積累均有顯著影響。在自然光照條件下，黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的花青素含量范圍在0.14～8.99 mg·g-1之間，在遮光條件下果實(shí)內(nèi)的花青素含量只達(dá)到0.16～6.90 mg·g-1。另外，根據(jù)測(cè)定結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在S3時(shí)期果實(shí)內(nèi)的花青素和多糖均有一個(gè)非常顯著的變化特點(diǎn)：此期自然光照條件下果實(shí)內(nèi)的花青素含量高達(dá)5.02 mg·g-1，相比S2時(shí)期呈現(xiàn)出急速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而在遮光條件下同一時(shí)期果實(shí)內(nèi)的花青素含量?jī)H有0.50 mg·g-1；同樣，在自然光照條件下生長(zhǎng)的黑果枸杞其多糖含量已達(dá)到25.42 mg·g-1，相比S2時(shí)期的多糖含量呈現(xiàn)出激增趨勢(shì)，而在遮光條件下果實(shí)內(nèi)的多糖含量只有2.39 mg·g-1。這一測(cè)定結(jié)果說明，S3時(shí)期是花青素和多糖積累的一個(gè)非常關(guān)鍵的時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期對(duì)花青素和多糖生物合成產(chǎn)生影響的相關(guān)環(huán)境因素會(huì)直接影響到當(dāng)年黑果枸杞果實(shí)的品質(zhì)，這也為以后的生產(chǎn)實(shí)踐提供了重要的理論研究基礎(chǔ)。相比之下，遮光處理的黑果枸杞在其他幾個(gè)時(shí)期果實(shí)內(nèi)花青素和多糖含量的變化都不明顯。殷培蕾等人在研究中提到，光照對(duì)苦蕎芽中多酚類物質(zhì)及抗氧化活性均有重要影響[29]；但在本研究中發(fā)現(xiàn)，遮光對(duì)黑果枸杞多酚積累并沒有顯著影響，對(duì)于檢測(cè)中沒有顯著影響的幾個(gè)結(jié)果，可能因?yàn)閷?duì)遮光處理的時(shí)間和方法把握不準(zhǔn)確，結(jié)論有一定的局限性。因此，下一步我們會(huì)在此次研究結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)遮光處理的時(shí)間和方法進(jìn)行改進(jìn)，包括對(duì)黑果枸杞果實(shí)內(nèi)的多酚類型和含量作進(jìn)一步的測(cè)定分析以及設(shè)置遮光時(shí)長(zhǎng)梯度和遮光程度變化等，進(jìn)一步確定光照影響黑果枸杞果實(shí)中有效活性成分積累的關(guān)鍵時(shí)期，從而為下一步對(duì)光誘導(dǎo)果實(shí)內(nèi)有效活性成分深層機(jī)理的揭示和珍稀資源特異種質(zhì)的合理利用及遺傳育種奠定重要理論基礎(chǔ)。

綜上所述，光照可能是影響黑果枸杞果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良的決定性環(huán)境因素之一，遮光處理顯著降低了黑果枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和果實(shí)品質(zhì)，與正常生長(zhǎng)條件下的果實(shí)相比，表現(xiàn)出明顯的差異，這為以后對(duì)黑果枸杞的良種化培育和人工規(guī)?；耘嘁约氨Ｗo(hù)和持續(xù)利用這一寶貴資源提供了理論依據(jù)。