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      5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株吞噬活性和活性氧自由基的影響

      2018-07-28 07:29:18陳向齊宋洪濤陳勝平劉志宏翁巧玲
      實(shí)用皮膚病學(xué)雜志 2018年3期
      關(guān)鍵詞:丙酸培養(yǎng)箱痤瘡

      陳向齊,宋洪濤,陳勝平,林 兵,劉志宏,昊 霞,翁巧玲

      痤瘡(acne)是一種慢性炎癥性皮膚病,好發(fā)于青少年,發(fā)病率高達(dá)70%~87%。痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes,P.acnes)是引起痤瘡的主要病原體。該菌寄生于皮膚毛囊及皮脂腺,屬革蘭陽性厭氧短桿菌,一般情況下為皮膚正常菌群。當(dāng)青春期來臨時(shí),毛囊口被角栓堵塞,而皮脂腺分泌功能更旺盛,局部厭氧條件、脂肪酸等成分助長了痤瘡丙酸桿菌的過度繁殖,從而使其致病。巨噬細(xì)胞是固有免疫的免疫效應(yīng)細(xì)胞中的一員,通過固有的模式識(shí)別受體對(duì)入侵的病原體的病原相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別,結(jié)合后將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi),激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB,啟動(dòng)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄,表達(dá)趨化因子、細(xì)胞因子,如NO、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α,使巨噬細(xì)胞激活,發(fā)揮吞噬和殺傷活性[1]。巨噬細(xì)胞在先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答中起重要作用[2]。2004年Holland等[3]發(fā)現(xiàn),無瘢痕傾向的痤瘡患者早期炎癥皮損中有大量CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和朗格漢細(xì)胞等細(xì)胞浸潤,大量表達(dá)人類白細(xì)胞抗原,局部血管形成并表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子,在24 h到達(dá)高峰,然后消退。但5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法(5-aminolevulinicacid photodynamic therapy,5-ALA-PDT)能否對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株的吞噬活性和活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生影響,本文進(jìn)行了研究。

      1 材料與方法

      1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

      細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng),在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下,將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(購自上海細(xì)胞生物研究所)接種于培養(yǎng)皿中。隔天更換培養(yǎng)基,2~3 d進(jìn)行一次傳代處理,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

      1.2 方法

      1.2.1 滅活細(xì)菌液的準(zhǔn)備 挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌(廣東省微生物研究所,ATCC6919)的菌落,并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中,在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3 d,用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù),以生理鹽水調(diào)配細(xì)菌濃度至1×108個(gè) /ml,95 ℃水滅活 15 min。

      1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 空白組:單純RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)。模型組:按文獻(xiàn)[4]的方法,給予終濃度2.25×107個(gè)/ml濃度痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激RAW264.7細(xì)胞(2.25×105個(gè)/ml)2 h。5-ALA-PDT處理組(試驗(yàn)組):分3個(gè)濃度,分別為0.03、0.06、0.12 mmol/L。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次4個(gè)復(fù)孔,取均值。

      1.2.3 中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬活性 RAW264.7細(xì)胞以 1×106個(gè)/ml鋪黑色 96孔板(100 μl),置于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)過夜。除空白組外,其他組給予終濃度1×108個(gè)/ml細(xì)菌滅活液刺激2 h,感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=100:1?,F(xiàn)配5-ALA液(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司),給予終濃度0.03、0.06、0.12 mmol/L給藥,空白組、模型組加等量的PBS液。每個(gè)濃度4 個(gè)重復(fù)孔,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。給予16 J/cm2的紅光照射。吸出舊的培養(yǎng)基,加入新的培養(yǎng)基100 μl,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),20 h后取出。巨噬細(xì)胞的吞噬活性用中性紅法測(cè)定,吸出培養(yǎng)基,每孔加0.1%中性紅懸濁液100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄去上清液,用200 μl PBS液沖洗未被吞噬的中性紅,重復(fù)3次。每孔加200 μl細(xì)胞裂解液醋酸-乙醇(1:1),靜置2 h,使細(xì)胞溶解,混勻后在酶標(biāo)儀上測(cè)定 540 nm處吸光度(A),以無細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)液為調(diào)零對(duì)照。

      1.2.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度 RAW264.7細(xì)胞以 5×104個(gè) /ml鋪黑色 96孔板(100 μl),置于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)過夜。除空白組外,其他組給予終濃度5×106個(gè)/ml濃度細(xì)菌滅活液刺激2 h,感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=100:1。其余方法同中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。在待測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)基中加入二氫乙錠(dihydroethidium,DHE,上海西塘生物技術(shù)有限公司,最終濃度為10 μmol/L),在37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用預(yù)熱(37℃)的PBS沖洗3次,每次1~2 min,用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光,并拍照。

      1.2.5 活性氧自由基檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基熒光強(qiáng)度。各孔中加入1:1 000用無血清DMEM稀釋2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dihydrochloride acetyl acid dichloride,DCFH-DA,上海Sigma公司)探針 30 μl(終濃度 10 μmol/L),在培養(yǎng)箱中孵育30 min后去除探針,用PBS沖洗3遍,徹底清除未結(jié)合的熒光探針。每孔加入無血清DMEM 100 μl,在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h,在485 nm激發(fā)波長下,用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(xˉ ±s)表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,各組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)用LSD法,方差不齊時(shí)用Tambane's T2法,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 5-ALA-PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,空白組A值為0.72±0.02,模型組A值為1.06±0.03,0.03 mmol/L組A值為0.91±0.04,0.06 mmol/L組A值為0.89±0.02,0.12 mmol/L組A值為0.76±0.01,用LSD檢驗(yàn),F(xiàn)=99.316,P=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組A值和空白組比較,P=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.06 mmol/L組和模型組比較,P=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.12 mmol/L組和0.03 mmol/L組比較,P=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1 )。

      2.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度

      圖1 5-ALA-PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

      圖2 5-ALA-PDT處理對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

      圖3 5-ALA-PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細(xì)胞ROS的影響

      熒光顯微鏡下顯示0.03 mmol/L 5-ALA處理組小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株有少量熒光,0.12 mmol/L5-ALA處理組熒光明顯增強(qiáng),表明0.12 mmol/L 5-ALA處理組產(chǎn)生大量ROS(圖2)。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度可見:0.03 mmol/L組細(xì)胞內(nèi)只見少量微弱紅色熒光;0.12 mmol/L組細(xì)胞內(nèi)有大量紅色熒光 。

      2.3 5-ALA-PDT對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株ROS的影響

      空白組熒光強(qiáng)度為0.25±0.01、模型組0.27±0.02,0.03 mmol/L 組 1.32±0.29,0.06 mmol/L 組 1.82±0.32,0.12mmol/L組2.47±0.12,用Tambane's T2檢驗(yàn)F=94.865,P=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組和空白組比較,P=0.679,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.03 mmol/L組和空白組比較,P=0.026,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.12 mmol/L組和0.03 mmol/L組比較,P=0.012,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

      3 討論

      光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)作為光療法的分支,是一種新興療法,用于治療痤瘡療效顯著,不良反應(yīng)小,已成為目前的研究熱點(diǎn)[2,4]。其作用機(jī)制是在患處應(yīng)用光敏劑,在光照的基礎(chǔ)上,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng),從而治愈疾病。以光敏劑5-ALA為例,5-ALA經(jīng)上皮細(xì)胞及毛囊皮脂腺吸收后,可以通過血紅素合成途徑代謝為原卟啉Ⅸ(protoporphyrin Ⅸ,PpⅨ),當(dāng)光線照射時(shí),PpⅨ受激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)氧和自由基,使得細(xì)胞凋亡,皮脂腺萎縮,痤瘡丙酸桿菌被殺滅[5,6]。

      巨噬細(xì)胞對(duì)異物,如細(xì)菌等有吞噬和消化的功能,在非特異性免疫反應(yīng)中起重要作用,中性紅法可用來檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。筆者的研究結(jié)果表明,用痤瘡丙酸桿菌刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞后吞噬活性增強(qiáng),給予不同濃度5-ALA-PDT處理后吞噬活性均降低,隨著濃度升高,吞噬活性降低更明顯,呈劑量依賴性。表明 5-ALA-PDT能減輕小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株吞噬活性,可能減輕痤瘡的炎癥反應(yīng)。

      ROS是生物體內(nèi)含有氧原子和活性物質(zhì)的總稱。除了機(jī)體的正常代謝能產(chǎn)生ROS外,免疫反應(yīng)和抗生素等均可導(dǎo)致ROS水平升高。由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS可直接殺死病原微生物,起到免疫防御作用。熒光顯微鏡能直接觀察到ROS的強(qiáng)度,熒光酶標(biāo)儀能定量檢測(cè)ROS水平。在熒光顯微鏡下觀察到小鼠RAW264.7細(xì)胞株ROS變化情況:正常情況下小鼠巨噬細(xì)胞264.7細(xì)胞株ROS水平低,不易觀察到,5-ALA-PDT有效增加痤瘡丙酸桿菌感染后細(xì)胞內(nèi)ROS水平,隨著5-ALA濃度升高,ROS水平持續(xù)升高,呈劑量依賴性??赡苁?-ALAPDT治療后產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧,使ROS水平上升,將痤瘡丙酸桿菌殺死,從而治療痤瘡。下一步研究可檢測(cè)不同處理組單線態(tài)氧等不同ROS成分水平,進(jìn)一步研究5-ALA-PDT對(duì)ROS的影響。

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