龐海月，吳黌坦，鄭永標(biāo)，陳煜沛，黃立森，葉子堅(jiān)，王貴弘

（1.廈門醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，福建廈門361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院天然化妝品福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建廈門361023；3.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州350117）

玳玳花（Citrus aurantium）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus reticulata Banco）的常綠灌木，分布于中國(guó)南部各地區(qū)。玳玳花全草含有強(qiáng)心甙和非強(qiáng)心甙類成分，在多國(guó)藥典中均有記錄。中醫(yī)稱之具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜、疏肝理氣、消食、化痰等功效，用于治療慢性心功能不全、充血性心力衰竭和癲癇等急性病。玳玳花作為茶飲，微苦，香氣濃郁，具有減肥瘦身的效果。玳玳花花蕾中的揮發(fā)油主要有檸檬烯、芳樟醇、香茅醇、牦牛兒醇等。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，玳玳花的研究多集中于其香氣和精油成分，對(duì)其萃取物的整體研究較少。

隨著科技的發(fā)展，人類在人體衰老課題研究中取得越來(lái)越多成果，尤其對(duì)氧化損傷與衰老的關(guān)系進(jìn)行了較多闡述，更初步證實(shí)了自由基引起的氧化損傷是人體衰老的主要元兇。本研究采用5種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法對(duì)玳玳花黃酮的抗氧化活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，并利用H2O2和對(duì)乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol，APAP）誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞損傷模型，對(duì)其細(xì)胞水平的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，為其之后能夠作為天然食品和化妝品類抗氧化劑及抗衰老的應(yīng)用做基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玳玳花由福建省農(nóng)科院生態(tài)所林忠寧副研究員提供；人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

大孔吸附樹脂D101、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene，BHT）、吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）、硝基藍(lán)四氮唑（Nitro blue tetrazolium，NBT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、對(duì)乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol，APAP）、沒食子酸（Gallic acid，GAE）、福林酚（Folinciocalteau reagent）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）：美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）、10 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液：碧云天生物技術(shù)研究所。所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZoneR冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100：日本東京理化器械株式會(huì)社；多功能酶標(biāo)儀SpectraMaxRi3x：美國(guó)Molecular Devices公司；梅特勒ME204E電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；Thermo BB15 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：精藝興業(yè)科技有限公司；徠卡DMi8倒置顯微鏡：精藝興業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玳玳花黃酮的獲取

玳玳花粉碎后，準(zhǔn)確稱取100 g，加純水[液料比5∶1（mL/g）]，超聲波功率為 600 W，超聲萃取 4 h，過(guò)濾，45℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，濃縮至褐色浸膏。經(jīng)少量純水重新溶解后，濾紙過(guò)濾，冷凍干燥處理得到粗提物樣品12.16 g，4℃冰箱備用。

稱取大孔樹脂D101 50 g，加入無(wú)水乙醇浸泡24 h激活。之后將激活的大孔樹脂裝入長(zhǎng)25cm，直徑1.5cm的層析柱中，用無(wú)水乙醇沖洗至洗脫液滴入純水中無(wú)渾濁現(xiàn)象，再用純水洗脫至洗脫液澄清，管柱上方留1 cm～2 cm高的液面。稱取1.3.1中得到的粗提物樣品1 g用少量純水溶解后，濕法上樣。先用純水200 mL洗脫后，再用25%的乙醇-水溶液洗脫，此洗脫液經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥后即為玳玳花黃酮（Citrus aurantium flavones，CF），黃酮含量為 2.68 mg/g。

1.3.2 總抗氧化能力測(cè)定

參照ABTS試劑盒說(shuō)明配制ABTS所需工作溶液。用樣品配制溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋。把10 mmol/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。在96孔板的每孔中加入200 μL ABTS工作液，空白對(duì)照孔中加入10 μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔中加入10 μL待測(cè)樣品。將加好樣品的孔板混和均勻，室溫孵育2 min～6 min后測(cè)定734 nm處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity（TEAC）表示，即所測(cè)樣品的總抗氧化能力用同等抗氧化效果的Trolox的濃度來(lái)代表。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[3]方法，準(zhǔn)確稱取一定量的DPPH，用無(wú)水乙醇配置成0.1 mmol/L的溶液，避光冷藏備用。將待測(cè)樣品稀釋成不同濃度（0.012 5、0.025、0.5、1 mg/mL），陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照分別采用BHT和無(wú)水乙醇。取200 μL樣品液和對(duì)照溶液，均加入等體積的0.1 mmol/L DPPH溶液，渦旋混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm測(cè)定吸光值，計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：OD0為不加樣品的空白組；OD1為扣除干擾色后的樣品組。

1.3.4 清除超氧陰離子（SOD-like）能力測(cè)定

用無(wú)菌水配制 60 μmol/L PMS、468 μmol/L NADH及150 μmol/L NBT工作液。取100 μL無(wú)菌水、濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL 的樣品溶液和BHT溶液依次與100 μL PMS、NADH及NBT溶液混合均勻，加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3孔重復(fù)，室溫靜置5 min后，以酶標(biāo)儀測(cè)各孔于560 nm處的吸光值。

式中：A0為未添加樣品的對(duì)照組；A1為添加樣品的實(shí)驗(yàn)組。

1.3.5 MTT檢測(cè)樣品對(duì)HepG2細(xì)胞株的作用

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁細(xì)胞，以每孔100 μL（5×103個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入用DMSO溶解的樣品（終濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL）每個(gè)濃度設(shè)3組重復(fù)，補(bǔ)充培養(yǎng)液使每孔的總體積為200 μL（每孔的DMSO含量低于2.5%），繼續(xù)培養(yǎng)24 h?？瞻讓?duì)照組（Control）以含DMSO的培養(yǎng)液代替樣品，空白調(diào)零組為無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培養(yǎng)5 h，吸除干凈每孔中的培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

式中：A0為未添加樣品的對(duì)照組；A1為添加樣品的實(shí)驗(yàn)組。

1.3.6 HepG2細(xì)胞株氧化損傷測(cè)定

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁細(xì)胞，以每孔100 μL（5×103個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入用DMSO溶解的樣品（終濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL）每個(gè)濃度設(shè)3組重復(fù)，補(bǔ)充培養(yǎng)液使每孔的總體積為200 μL（每孔的DMSO含量低于2.5%），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為400 μmol/L H2O2（或12 mmol/L APAP）繼續(xù)培養(yǎng) 6 h?？瞻讓?duì)照組（Control）以含DMSO的培養(yǎng)液代替樣品，空白調(diào)零組為無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察各組檢測(cè)孔中細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。之后每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培養(yǎng)5 h，吸除干凈每孔中的培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

式中：A0為未添加樣品的對(duì)照組；A1為添加樣品的試驗(yàn)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 CF抗氧化活性

以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)方程：R2=0.999 1通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算CF總抗氧化能力，結(jié)果表明，CF的總抗氧化活性為（5.28±0.02）mmol/g；通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定，結(jié)果表明其半數(shù)抑制率濃度為（0.52±0.02）mg/mL；通過(guò)對(duì)超氧陰離子（SOD-like）清除能力測(cè)定，結(jié)果表明其半數(shù)抑制率濃度為（0.074±0.002）mg/mL。

2.2 CF對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞株的作用

CF對(duì)HepG2細(xì)胞株的作用見圖1。

通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)CF對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的作用，結(jié)果表明CF對(duì)HepG2無(wú)明顯抑制或增強(qiáng)的效果。

2.3 CF抗H2O2誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞株HepG2氧化損傷測(cè)定

CF對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞株氧化損傷的作用見圖2。

圖1 CF對(duì)HepG2細(xì)胞株的作用Fig.1 The effect of Citrus aurantium flavones on HepG2 cell lines

圖2 CF對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞株氧化損傷的作用Fig.2 The effect of Citrus aurantium flavones on hydrogen peroxide-induced oxidative stress of HepG2 cell lines

通過(guò)測(cè)定CF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2的氧化損傷作用，結(jié)果表明，在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，CF在該模型中表現(xiàn)的作用不同，其中玳玳花黃酮濃度在0.04 mg/mL時(shí)，較顯著的降低細(xì)胞氧化損傷水平。從圖2a中H2O2處理組可以看出，H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞在形態(tài)出現(xiàn)明顯鼓泡、變圓，而經(jīng)CF預(yù)處理的HepG2細(xì)胞較H2O2處理組在細(xì)胞形態(tài)上均有明顯改善，圖2b中的柱狀圖更直觀的表明不同濃度CF在細(xì)胞水平上對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2的氧化損傷具有一定的修復(fù)作用。

2.4 CF抗APAP誘導(dǎo)的HepG2人肝癌細(xì)胞株氧化損傷測(cè)定

CF對(duì)APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞株氧化損傷的作用見圖3。

圖3 CF對(duì)APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞株氧化損傷的作用Fig.3 The effect of Citrus aurantium flavones on 4-acetamidophenol-induced oxidative stress of HepG2 cell lines

通過(guò)測(cè)定CF對(duì)APAP誘導(dǎo)的HepG2的氧化損傷作用，結(jié)果表明，CF濃度在0.04 mg/mL時(shí)，能夠降低細(xì)胞氧化損傷水平，但當(dāng)濃度大于0.1 mg/mL或低于0.04 mg/mL時(shí)，表現(xiàn)出和12 mmol/L APAP相近的細(xì)胞毒性。從圖3a可以看出，APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞在形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮、變圓甚至破裂等，而經(jīng)CF預(yù)處理的HepG2細(xì)胞較12 mmol/L APAP預(yù)處理組在細(xì)胞形態(tài)上有一定改善，圖3b中的柱狀圖更清晰的看出CF在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，在APAP誘導(dǎo)的HepG2的氧化損傷模型中的作用效果。

3 結(jié)論

采用總抗氧化能力、DPPH清除能力和SOD清除能力3種生化指標(biāo)與H2O2和APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型，共同評(píng)估玳玳花黃酮的抗氧化損傷能力。發(fā)現(xiàn)CF在生化水平測(cè)試中表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，而兩種細(xì)胞模型測(cè)定的結(jié)果又表現(xiàn)出一定的差異性。在APAP模型中，CF濃度高于0.1 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)與APAP近似甚至更強(qiáng)的毒性。CF較好的抗氧化能力可為其在食品天然防腐劑的應(yīng)用提供事實(shí)依據(jù)，而CF在較高濃度，與APAP共用時(shí)表現(xiàn)強(qiáng)烈細(xì)胞毒性這一點(diǎn)為其提供了使用量和配伍時(shí)的禁忌。本次的研究結(jié)論為玳玳花黃酮類提取物之后開發(fā)成天然抗氧化劑奠定了一定的理論基礎(chǔ)。