楊偉光，劉盼盼，袁光孝，毛培勝，齊冬梅，董曉兵，劉輝，李曉霞*，劉公社*

(1.中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，北京 100193)

種子是裸子植物和被子植物特有的繁殖體，大多數(shù)有花植物通過有性生殖和產(chǎn)生種子繁衍后代，種子的活力和成功萌發(fā)、成苗決定著植物種群的繁衍和生存，直接影響作物的產(chǎn)量。

羊草(Leymuschinensis)是我國重要的多年生禾本科牧草資源，由于其野生性較強，種子存在著發(fā)芽率偏低的現(xiàn)象[1]，嚴(yán)重影響了羊草的生產(chǎn)應(yīng)用。目前關(guān)于羊草萌發(fā)率低的主要原因無統(tǒng)一的定論，有抑制物引起的生理性休眠[2]，有因種子本身基因型或收獲地的土壤及氣候類型[3]、發(fā)芽溫度、物理阻礙和胚乳阻礙[4-7]等說法阻礙萌發(fā)。研究表明，除熱水浸種不利于羊草種子萌發(fā)外，其余方法如濃硫酸處理、冷層積處理、PEG處理、硝酸鉀溶液處理以及清水浸種等方法都能在一定程度上破除羊草種子休眠，提高發(fā)芽率[8-13]。另外，普遍研究認(rèn)為變溫能夠促進(jìn)羊草種子萌發(fā)，而恒溫則不利于其萌發(fā)。但以上這些研究尚無系統(tǒng)性的結(jié)論，主要原因是材料有限，均以1份或幾份羊草材料進(jìn)行研究，并未開展不同基因型之間的比較研究。雖然變溫促進(jìn)羊草種子萌發(fā)已證實，但變溫處理的窗口期及處理最短時長還不清楚。因此，需要對這些問題開展系統(tǒng)和深入的研究，進(jìn)一步揭示羊草種子萌發(fā)的規(guī)律，為生產(chǎn)實踐提供理論基礎(chǔ)。

本研究主要以43份羊草種質(zhì)為材料，對其萌發(fā)規(guī)律進(jìn)行研究，包括羊草不同基因型間種子萌發(fā)差異、羊草種子萌發(fā)的最優(yōu)條件、變溫對種子萌發(fā)的影響等，旨在闡明不同基因型羊草種子萌發(fā)的規(guī)律、初步探究變溫調(diào)控羊草種子的萌發(fā)規(guī)律，為羊草種子萌發(fā)研究提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，同時對羊草新品種選育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所有羊草種質(zhì)材料均來源于中國科學(xué)院植物研究所種質(zhì)資源圃，共43份，收獲地點為北京植物園，東經(jīng)116°12′，北緯39°59′，海拔 61.6 m，年均溫度12.8 ℃，年降水量 532.6 mm，≥0 ℃積溫4400 ℃，無霜期 190～195 d，極端最低溫度-13.8 ℃，極端最高溫度 38 ℃，土壤為棕壤土。收獲年份在2014-2015年，具體見表1。其中溫室內(nèi)測試出苗率所用材料為41份，光照培養(yǎng)箱內(nèi)測試萌發(fā)率的材料為35份，用于變溫測試萌發(fā)率的材料總計為4份。

1.2 實驗設(shè)計與方法

1.2.1溫室內(nèi)營養(yǎng)缽出苗率測定 取直徑11 cm裝有混合營養(yǎng)土(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)的營養(yǎng)缽，用平皿輕輕壓平土表，將營養(yǎng)缽放到盛水的托盤內(nèi)吸水過夜。取出50粒人工挑選的種子均勻地撒在土表，4次重復(fù)。用混合營養(yǎng)土均勻地撒在土表，形成0.5～1.0 cm的覆蓋層，并用平皿輕輕按壓覆蓋層，用噴霧壺噴濕土表。將托盤放到溫室內(nèi)(自然光照，相對濕度35%～45%，溫度16～38 ℃)，計算20 d內(nèi)出苗率，出苗標(biāo)準(zhǔn)為胚芽鞘伸出土表1 mm。

1.2.2光照培養(yǎng)箱萌發(fā)率測定 取鋪有浸濕濾紙的玻璃平皿，將30粒人工挑選的種子均勻地排列在濾紙上，4次重復(fù)。將皿蓋傾斜45°蓋到平皿上，平皿和皿蓋一起放入托盤內(nèi)，托盤內(nèi)倒入1 cm深的蒸餾水。將托盤放到光照培養(yǎng)箱{光照強度40 lx，相對濕度35%，溫度28 ℃[12 h晝(day, D)]/16 ℃[12 h夜(night, N)}中，計算20 d內(nèi)的萌發(fā)率，萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為胚根伸出1 mm。

1.2.3不同溫度處理種子萌發(fā) 1)變溫與恒溫處理：變溫處理為28 ℃(12 h晝)/16 ℃(12 h夜)，恒溫處理分別設(shè)16、20、22、28和37 ℃，光照培養(yǎng)箱測定萌發(fā)率。

2)變溫時長處理：在羊草種子萌發(fā)的前6 d，設(shè)18個不同時長變溫(change temperature，CT)處理，從變溫處理6 d逐步縮小到1 h，見表2。變溫處理后將種子取出立即放入恒溫28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)，對照組為一直恒溫(steady temperature，ST)和變溫萌發(fā)，4次重復(fù)。

表1 試驗材料來源與編號Table 1 Origin and codes of experimental

表2 變溫時長處理Table 2 The treatments of changing temperature for different times

CT:變溫Change temperature；ST:恒溫Steady temperature.下同The same below.

3)變溫時段處理：在萌發(fā)的前6 d，設(shè)14個處理(表3)，分別于不同萌發(fā)時段進(jìn)行28 ℃/16 ℃變溫處理，其他時段均置于恒溫28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)，對照組為一直恒溫萌發(fā)，4次重復(fù)。

表3 變溫時段處理Table 3 The treatments of changing temperature at different times

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0和Microsoft Excel軟件完成，使用Microsoft Excel和Origin 8.0軟件作圖。采用單因素方差分析和LSD最小顯著差異法檢驗不同基因型和不同變溫時長、時段處理的羊草種子萌發(fā)率的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種質(zhì)對羊草種子出苗率的影響

通過對41份不同基因型的種子在溫室內(nèi)的出苗率進(jìn)行測定，結(jié)果表明不同種質(zhì)間出苗率差異較大，出苗率從10.00%到61.33%，出苗率集中分布在20%～30%(圖1)，占所有出苗種質(zhì)材料的46.34%，表明羊草種子出苗率受種質(zhì)影響較大。

此外，通過光照培養(yǎng)箱對35份羊草材料種子萌發(fā)率進(jìn)行測定，結(jié)果顯示不同材料種子萌發(fā)率差異也較大，從36.67%到95.00%，主要集中在60%～100%，占所有萌發(fā)種質(zhì)材料的85.71%(圖2)，進(jìn)一步說明羊草種子的萌發(fā)率高低與種質(zhì)相關(guān)。

圖1 41份羊草種質(zhì)材料出苗率分布Fig.1 Distribution histogram of seed emergence rate of 41 different germplasms

圖2 35份羊草種質(zhì)材料種子萌發(fā)率分布Fig.2 Distribution histogram of seed germination rate of 35 different germplasms

2.2 不同溫度條件下羊草種子萌發(fā)率的變化

圖3 不同溫度條件下3種羊草種子的萌發(fā)率 Fig.3 The seed germination rate of 3 type L. chinensis under different constant temperature and 28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h) variable temperature 圖中的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同大寫字母或小寫字母代表材料間或處理間在 P<0.01或P<0.05水平上差異顯著，下同。The data in the picture are the mean±SE.The different capital or small letters indicate significant difference at the 0.01 or 0.05 level within materials or treatments.The same below.

2.2.1恒溫、變溫條件下羊草種子萌發(fā)規(guī)律 選取的XQ10-1、D23、SF2-1這3種羊草種質(zhì)材料，恒溫處理下(16、20、22、28、37 ℃)3種材料種子萌發(fā)率均低(<20%)，甚至萌發(fā)率為零(圖3)，同一種質(zhì)材料的羊草種子各恒溫間的萌發(fā)率差異不顯著。而變溫28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h)，3種羊草種子萌發(fā)率顯著增加，增幅50%～90%，且種質(zhì)間的種子萌發(fā)率也不同，XQ10-1、D23、SF2-1分別為52.50%、77.78%和90.83%，表明變溫可以顯著提高羊草種子萌發(fā)率。

2.2.2不同時長的變溫處理下羊草種子萌發(fā)規(guī)律 選取4種羊草種質(zhì)材料(D50，XQ10-1，2015年收獲的SF2-1和149)，進(jìn)行6 d內(nèi)不同時長變溫處理后再放到28 ℃恒溫條件下進(jìn)行萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)4種羊草種子所有的不同時長變溫處理的萌發(fā)率均極顯著(P<0.01)高于恒溫對照，且種子的萌發(fā)率在變溫處理1～5 d，隨著變溫時間的增加，萌發(fā)率有顯著提高(圖4)。除材料D50外，其余3種材料在變溫時長≥4 d的羊草種子萌發(fā)率與變溫對照相比差異不顯著，表明變溫處理3～4 d后羊草種子萌發(fā)率達(dá)到萌發(fā)最高值。

圖4 4種羊草種質(zhì)材料的種子萌發(fā)率對不同時長變溫處理的響應(yīng)Fig.4 The seed germination rate of 4 different L. chinensis under 28 ℃ constant temperature and 28 ℃(12 h)/16 ℃(12 h) variable temperature for various days

此外，與恒溫萌發(fā)對照相比，變溫處理1和2 d，種子萌發(fā)率極顯著提高(P<0.01)。變溫處理2與1 d相比，種子萌發(fā)率有顯著提高；而處理3 d以上與前一天相比，除SF2-1之外，其余種質(zhì)材料的種子萌發(fā)率均無顯著差異。因此，與恒溫對照相比，變溫處理1～2 d即可顯著提高羊草種子萌發(fā)率。

上述結(jié)果表明，變溫處理1 d，羊草種子萌發(fā)率就有極顯著提高(P<0.01)。為了進(jìn)一步探究1 d內(nèi)，即24 h內(nèi)變溫時長對羊草種子萌發(fā)影響的窗口期，以SF2-1為試驗材料，對萌發(fā)第1天以4 h為一個梯度進(jìn)行變溫處理，結(jié)果表明6個不同梯度處理中，羊草種子萌發(fā)率均較恒溫有極顯著提高(P<0.01)，而且變溫時間越長萌發(fā)率提高越大，當(dāng)變溫時長大于16 h后，萌發(fā)率不隨時間變長而繼續(xù)提高(圖5)，其中變溫8 h即可顯著提高羊草種子的萌發(fā)率(P<0.01)。

進(jìn)一步對萌發(fā)第8～12 h的1 h梯度變溫處理實驗表明，當(dāng)變溫處理1 h，雖然羊草種子萌發(fā)率有提高，但與恒溫對照相比差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)變溫時長為2 h以上時，羊草種子萌發(fā)率較恒溫對照顯著提高(P<0.05)，變溫時長為4 h時，萌發(fā)率極顯著(P<0.05)提高，說明變溫處理2 h為羊草種子萌發(fā)率提高的窗口期，見圖6。

圖5 4 h梯度不同時長變溫處理對羊草種子萌發(fā)的影響Fig.5 Germination rate in different duration of variable temperature under 4 h interval

圖6 1 h梯度不同時長變溫處理對羊草種子萌發(fā)的影響Fig.6 Germination rate in different duration of variable temperature under 1 h interval

1:恒溫對照Steady temperature (CK);2:變溫4 h Change temperature for 4 h;3:變溫8 h Change temperature for 8 h;4:變溫12 h Change temperature for 12 h;5:變溫16 h Change temperature for 16 h;6:變溫20 h Change temperature for 20 h;7:變溫24 h Change temperature for 24 h.

1:恒溫對照Steady temperature (CK);2:變溫1 h Change temperature for 1 h;3:變溫2 h Change temperature for 2 h;4:變溫3 h Change temperature for 3 h;5:變溫4 h Change temperature for 4 h.

2.2.3不同時段變溫處理對羊草種子萌發(fā)率的影響 為了探尋28 ℃/16 ℃變溫處理對種子萌發(fā)作用的具體時間段，選取4種不同基因型的種子進(jìn)行了6 d內(nèi)不同時段的變溫處理，即分別在第1天，第2天，依次到第6天進(jìn)行變溫處理，結(jié)果表明,與恒溫對照相比，第1天變溫處理，即可極顯著地提高種子的萌發(fā)率(P<0.01)；隨著變溫處理時間段的延后，種子萌發(fā)率的增長越少。與變溫對照相比，羊草種子萌發(fā)期間，越早對其進(jìn)行變溫處理，種子最終萌發(fā)率提高得越多，而較晚進(jìn)行變溫處理，例如第6天進(jìn)行變溫處理，萌發(fā)率提高不明顯(P>0.05)，見圖7。

圖7 4種基因型羊草種子的萌發(fā)率對不同時段變溫處理的響應(yīng)Fig.7 The germination rate of 4 genotype seeds in 28 ℃ constant temperature and 28 ℃(12 h)/16 ℃(12 h) variable temperature at different days

在6 d內(nèi)不同變溫時段變溫處理的研究中，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)第1 天進(jìn)行變溫，萌發(fā)率極顯著提高。為了進(jìn)一步探究變溫處理的敏感期，選取SF2-1為試驗材料，將萌發(fā)第1天分成6個4 h的時段進(jìn)行變溫處理，結(jié)果表明,與恒溫對照相比，各時段變溫處理的羊草種子萌發(fā)率均有極顯著(P<0.01)提高，而且不同時段變溫處理對萌發(fā)率提高幅度有差異，萌發(fā)開始的第8～12 h變溫處理，萌發(fā)率提高最多，即此時是變溫處理最敏感時期，見圖8。

3 討論與結(jié)論

圖8 羊草種子在萌發(fā)第1天不同時段對變溫處理的響應(yīng) Fig.8 The germination of seeds in 28 ℃ constant temperature and 28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h) changing temperature at different time period in first day 1:恒溫對照Steady temperature (CK);2:0～4 h變溫Change temperature on 0-4 h;3:4～8 h變溫Change temperature on 4-8 h;4:8～12 h變溫Change temperature on 8-12 h;5:12～16 h變溫Change temperature on 12-16 h;6:16～20 h變溫Change temperature on 16-20 h;7:20～24 h變溫Change temperature on 20-24 h.

3.1 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，羊草發(fā)芽率低的主要原因是其有較強及較長的種子休眠期[2]，且羊草種子萌發(fā)率的高低不僅與種子休眠程度有關(guān)，還與發(fā)芽溫度[14]、種子活性[15]、激素種類與含量水平[8]、氣候條件、土壤類型等有關(guān)[10]。且通過濃硫酸處理、冷層積處理、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)處理、硝酸鉀溶液處理以及清水浸種等方法均能在一定程度上提高羊草種子發(fā)芽率[6,16]。加入氟啶酮進(jìn)行羊草種子冷層積，可完全破除羊草種子休眠，使種子萌發(fā)率達(dá)到96%[17]；用30%聚乙二醇處理羊草種子24 h后，能顯著提高羊草種子發(fā)芽率和幼苗活力[10]；也有研究發(fā)現(xiàn)清水浸種1 d后用 30% NaOH處理60 min, 施加200 g·g-1GA3，可使羊草種子發(fā)芽率達(dá)到91%[8]。 以上這些研究為羊草生產(chǎn)實踐提供了依據(jù)，但是這些均屬于外界環(huán)境因素對種子萌發(fā)的影響，而本研究中對43份羊草種質(zhì)在溫室條件及光照培養(yǎng)箱中的萌發(fā)率進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同羊草種質(zhì)材料的種子萌發(fā)率差異顯著，說明羊草種子的萌發(fā)率與種質(zhì)密切相關(guān)，這一結(jié)論為今后選育具有高萌發(fā)率的羊草種質(zhì)及培育羊草新品種奠定了基礎(chǔ)，也為下一步從分子生物學(xué)方面探究不同種質(zhì)羊草種子萌發(fā)差異的分子機理奠定了理論基礎(chǔ)。

種子萌發(fā)是一個生理生化變化的過程，是在一系列酶的參與下進(jìn)行的，而酶的催化與溫度有密切的關(guān)系。前人研究發(fā)現(xiàn)，恒溫不利于羊草種子發(fā)芽，低溫和變溫都能顯著地提高種子萌發(fā)率[2,6,14,18-20]。何學(xué)青等[8]表示20 ℃(12 h)/30 ℃(12 h)可以最大限度地提高羊草種子的萌發(fā)率；藺吉祥等[21]在20 ℃(12 h)/30 ℃(12 h)萌發(fā)條件下，通過對發(fā)芽率、發(fā)芽速率、開始發(fā)芽時間以及50%種子發(fā)芽天數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)變溫處理可以顯著提高羊草種子的萌發(fā)率。本研究發(fā)現(xiàn)恒溫(16、20、22、28、37 ℃)條件下，3種基因型種子萌發(fā)率均低(<20%)，甚至萌發(fā)率為零，而變溫28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h)，3種羊草材料種子萌發(fā)率顯著增加，增幅50%～90%，這一結(jié)論與前人研究結(jié)果相類似[18]，但是不同種質(zhì)材料的種子對變溫的響應(yīng)是不同的，例如本研究中選用的XQ10-1、D23、SF2-1這3種材料，在28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h)變溫條件下的萌發(fā)率分別為52.50%、77.78%和90.83%，且三者之間差異極顯著(P<0.01)。溫度影響種子萌發(fā)的主要原因可能是溫度影響膜透性、膜結(jié)合蛋白的活力以及種子內(nèi)赤霉素GA3、細(xì)胞分裂素和 ABA的合成代謝等[22]，而在羊草中溫度影響種子萌發(fā)的機理有待深入研究。

變溫能夠促進(jìn)羊草種子萌發(fā)已被廣泛研究證實，但是變溫處理的窗口期及處理最短時長目前還尚不清楚。本研究通過進(jìn)一步細(xì)化1 d內(nèi)的變溫處理效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只要變溫處理時長大于2 h時，萌發(fā)率有顯著提高，且時長越長，萌發(fā)率增加幅度越大，但當(dāng)時長達(dá)到16 h后，萌發(fā)率不再隨時長而提高，說明2～16 h變溫處理導(dǎo)致的萌發(fā)率提高有一種累加效應(yīng)。此外，不同時間段處理，導(dǎo)致萌發(fā)率提高幅度不同，前12 h內(nèi)，處理時間越往后，萌發(fā)率提高幅度越大，8～12 h處理，產(chǎn)生了最大萌發(fā)率，說明變溫影響種子萌發(fā)的敏感期在種子萌發(fā)開始的8～12 h。在羊草種子萌發(fā)試驗中，得知吸脹過程大約在種子加水后6 h結(jié)束，而低溫是誘導(dǎo)種子萌發(fā)的敏感期,在8～12 h，這可能就是導(dǎo)致不同時段變溫處理萌發(fā)率不同的原因。而本實驗中變溫時長越長，萌發(fā)率越高，即變溫的疊加效應(yīng)，可能與低溫層積的原理相似[23]。因此，通過本研究確定羊草種子萌發(fā)響應(yīng)變溫的敏感期及關(guān)鍵時間點后，可采用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)方法(新一代測序技術(shù)等)闡明恒溫抑制及變溫誘導(dǎo)羊草種子萌發(fā)的分子機理，為進(jìn)一步解析羊草種子萌發(fā)的分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

3.2 結(jié)論

羊草種子萌發(fā)率不僅與羊草種質(zhì)有關(guān)，而且受萌發(fā)溫度影響較大。41份不同羊草種質(zhì)材料的種子間溫室內(nèi)出苗率差異較大，出苗率從10.00%到61.33%，出苗率集中分布在20%～30%，另外其中的35份羊草種子材料在光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)率差異也較大，從36.67%到95.00%，主要集中在60%～100%。恒溫條件下種子萌發(fā)率均較低，而變溫28 ℃/16 ℃可顯著提高種子萌發(fā)率，增幅50%～90%。 且變溫處理對種子萌發(fā)有時間劑量累加效應(yīng)，即變溫處理時間越長，萌發(fā)率提高越大。變溫處理在第1天的效應(yīng)最大，1 d內(nèi)影響種子萌發(fā)的時長在2～16 h，高于16 h萌發(fā)率不隨時間增加，低于2 h萌發(fā)率提高不顯著；此外還發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)24 h之內(nèi)，羊草種子對變溫處理有一個敏感的窗口期，即8～12 h，在這個時段內(nèi)變溫處理對種子萌發(fā)率提高最為顯著。