儲(chǔ)斌，席貽龍，朱凌云，馮若楠

安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源的保護(hù)和利用研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，蕪湖 241000

抗生素的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是20世紀(jì)最重要的科學(xué)成就之一?？股夭粌H被廣泛地用于人和動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，還被作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加于飼料中用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]。常規(guī)服用的抗生素，約有50%～90%以原藥或其代謝物形式通過(guò)糞尿被排出體外，然后通過(guò)污水處理后間接進(jìn)入環(huán)境，或通過(guò)施肥直接進(jìn)入環(huán)境中[2]。紅霉素的長(zhǎng)期使用使得地表水、地下水以及處理過(guò)的污水中均有殘留[3-7]，其生物活性即使是在非常低的濃度下(ng·L-1)也可能威脅水生態(tài)環(huán)境和人類健康[8-11]。因此，研究紅霉素對(duì)水生生物的影響具有重要的意義。

有關(guān)紅霉素對(duì)水生生物的毒性作用研究，已有一些報(bào)道：研究所使用的受試生物包括細(xì)菌、藻類、浮萍、原生動(dòng)物、輪蟲、枝角類、庫(kù)蚊、魚類和兩棲動(dòng)物等類群的多種生物；實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)涉及半數(shù)致死濃度等急性毒性實(shí)驗(yàn)指標(biāo)以及存活、生長(zhǎng)、生殖和遺傳毒性等慢性毒性實(shí)驗(yàn)指標(biāo)[8,12-21]。然而，上述研究均只涉及單一世代的受試生物。自然水體中，水生生物是持續(xù)暴露于環(huán)境污染物之中的，僅研究預(yù)先沒(méi)有暴露于污染物中的母體可能會(huì)低估污染物的毒性作用[22-24]。因此，研究污染物對(duì)連續(xù)世代的水生生物的毒性作用具有重要的意義；但有關(guān)紅霉素對(duì)連續(xù)世代的枝角類存活和生殖等的影響尚未見(jiàn)報(bào)告。

多刺裸腹溞屬于甲殼綱、枝角亞目、裸腹溞屬，是許多淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。由于其生命周期短，對(duì)污染物敏感性強(qiáng)，能通過(guò)孤雌生殖獲得純系，因此被廣泛用于水體污染物的毒性監(jiān)測(cè)和生態(tài)毒理學(xué)研究[25-28]。近幾年來(lái)，以其為受試生物開(kāi)展枝角類連續(xù)世代的毒理學(xué)研究在逐漸增多[26-29]。本文以多刺裸腹溞為研究對(duì)象，研究了紅霉素對(duì)其連續(xù)3個(gè)世代(F0、F1和F2)生活史參數(shù)的影響，旨在彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)外此方面研究之不足，揭示紅霉素毒性隨其孤雌生殖世代數(shù)增加而變化的規(guī)律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

受試動(dòng)物：試驗(yàn)用多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)由香港科技大學(xué)提供，在(25±1) ℃、自然光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行克隆培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)，以EPA(通過(guò)溶解96 mg NaHCO3、60 mg CaSO4、60 mg MgSO4和4 mg KCl于1 L蒸餾水中配制而成)[30]為培養(yǎng)液，以用HB-4培養(yǎng)基[31]培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長(zhǎng)期的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為食物。斜生柵藻離心濃縮并經(jīng)顯微計(jì)數(shù)后使用，投喂密度為1.0×106cells·mL-1[32]。

實(shí)驗(yàn)藥品：試驗(yàn)用紅霉素(純度≥98%)購(gòu)于Sigma-Slarbio公司。實(shí)驗(yàn)前，用丙酮將紅霉素配制成1 g·L-1的原液，然后用蒸餾水稀釋成10 mg·L-1的母液，母液每周更換1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)用EPA將母液配制成所需要的濃度。

1.2 多刺裸腹溞生活史實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)紅霉素對(duì)多刺裸腹溞存活和生殖的7 d-NOEC值為50 mg·L-1 [8]，實(shí)驗(yàn)將紅霉素濃度設(shè)置為6個(gè)梯度，分別為0.02、0.2、2、20、200和2 000 μg·L-1，另設(shè)空白對(duì)照組和丙酮(助溶劑)對(duì)照組(其中丙酮含量與2 000 μg·L-1濃度組中的含量相同，為0.5‰)。實(shí)驗(yàn)在與預(yù)培養(yǎng)相同的條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)選取多刺裸腹溞各世代于第3窩所產(chǎn)的幼體(齡長(zhǎng)<12 h)進(jìn)行；其中，F(xiàn)0代幼體為預(yù)培養(yǎng)狀態(tài)下多刺裸腹溞在第3代第3窩所產(chǎn)的雌性幼體，F(xiàn)1代幼體為F0代在實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下第3窩所產(chǎn)的雌性幼體，F(xiàn)2代幼體為F1代在實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下第3窩所產(chǎn)的雌性幼體。實(shí)驗(yàn)在6孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行，每孔加入10 mL測(cè)試液(內(nèi)含密度為1.0×106cells·mL-1的斜生柵藻)和1只多刺裸腹溞幼體，每個(gè)濃度設(shè)12個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每天更換50%測(cè)試液一次(內(nèi)含密度為1.0×106cells·mL-1的斜生柵藻)，每12小時(shí)觀察并記錄1次多刺裸腹溞的存活數(shù)、繁殖窩數(shù)和每窩所產(chǎn)的幼體數(shù)，并移出幼體。實(shí)驗(yàn)持續(xù)到所有原初個(gè)體死亡為止；死亡標(biāo)準(zhǔn)以晃動(dòng)杯子15 s不動(dòng)為準(zhǔn)[8,33]。

表1 連續(xù)3個(gè)世代暴露于不同濃度紅霉素溶液中多刺裸腹溞的存活和生殖參數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 1 Parameters of survival and reproduction of three successive generations of M. macrocopa exposed to different erythromycin concentrations (Mean±SE)

注：*與各世代的空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Note: *significantly different from the blank controls in each generation (P<0.05).

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPASS 19.0分析軟件對(duì)各生活史參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素、雙因素方差分析和多重比較(LSD檢驗(yàn))，以揭示不同紅霉素濃度、世代數(shù)以及它們之間的交互作用對(duì)多刺裸腹溞各生活史參數(shù)影響的顯著性。

2 結(jié)果(Results)

與空白對(duì)照組相比，暴露于0.5‰的丙酮(助溶劑)溶液中多刺裸腹溞，除了F1代和F2代的首次生殖年齡顯著減小了13.73%和16.00%外(P<0.05)，3個(gè)世代多刺裸腹溞的其他各生活史參數(shù)均未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.1 紅霉素濃度對(duì)連續(xù)3個(gè)世代多刺裸腹溞存活的影響

紅霉素濃度對(duì)多刺裸腹溞F0代平均壽命的影響表現(xiàn)出“低促高抑”的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，但其對(duì)平均壽命影響的顯著性隨著多刺裸腹溞世代數(shù)的增加而消失(P>0.05)。與空白對(duì)照組相比，暴露于0.02 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均壽命延長(zhǎng)了10.26%(P<0.05)，但暴露于2～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的平均壽命則縮短了25.87%～54.84%(P<0.05)；暴露于各濃度紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1和F2代的平均壽命均未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.2 紅霉素濃度對(duì)連續(xù)3個(gè)世代多刺裸腹溞首次生殖年齡的影響

紅霉素濃度對(duì)多刺裸腹溞F0代的首次生殖年齡無(wú)顯著性影響(P>0.05)，但卻顯著地影響了多刺裸腹溞F1和F2代的首次生殖年齡(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，暴露于0.2、20～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的首次生殖年齡減小了4.90%～15.69%(P<0.05)，暴露于0.2～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的F2代的首次生殖年齡減小了5.00%～16.00%(P<0.05)(表1)。

2.3 紅霉素濃度對(duì)連續(xù)3個(gè)世代多刺裸腹溞生殖窩數(shù)、窩卵數(shù)和總后代數(shù)的影響

與空白對(duì)照組相比，暴露于20 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的生殖窩數(shù)減小了55.76%(P< 0.05)，但暴露于各濃度紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1和F2代的生殖窩數(shù)并未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。

表2 紅霉素濃度對(duì)連續(xù)暴露3個(gè)世代的多刺裸腹溞的存活和生殖參數(shù)的影響(雙因素方差分析)Table 2 Effects of erythromycin (ER) concentration on parameters of survival and reproduction of three successive generations of M. macrocopa (Two-way ANOVA)

紅霉素濃度對(duì)多刺裸腹溞窩卵數(shù)的顯著性影響只出現(xiàn)在F1代(P<0.05)，表現(xiàn)為與空白對(duì)照組相比，暴露于20和200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的窩卵數(shù)分別增加了28.87%和10.18%(表1)。

紅霉素濃度對(duì)多刺裸腹溞總后代數(shù)的顯著性影響出現(xiàn)在F0和F1代(P<0.05)，在F2代中消失(P>0.05)。與空白對(duì)照組相比，暴露于2～200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的總后代數(shù)減少了43.99%～62.21%(P< 0.05)，而暴露于20和200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的總后代數(shù)分別增加28.56%和37.17%(P<0.05)(表1)。

雙因素方差分析結(jié)果表明，多刺裸腹溞的平均壽命、首次生殖年齡和生殖窩數(shù)受世代數(shù)、紅霉素濃度以及兩者間的交互作用的顯著影響，窩卵數(shù)受世代數(shù)和紅霉素濃度間交互作用的顯著影響，總后代數(shù)受世代數(shù)以及世代數(shù)和紅霉素濃度間交互作用的顯著影響(表2)。

3 討論(Discussion)

3.1 助溶劑對(duì)枝角類生活史參數(shù)的影響

丙酮的毒性在各種有機(jī)溶劑中最低，所以丙酮是水生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)中一種常用的有機(jī)溶劑[34-35]；但在水生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)中，丙酮對(duì)受試生物的影響并非可以完全忽視。Sánchez等[36]發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，10-4μg·L-1的丙酮對(duì)大型溞母代和F1代第1窩個(gè)體所有生活史參數(shù)均無(wú)顯著性影響，但卻提高了F1代第3窩個(gè)體的窩卵數(shù)和總后代數(shù)。Chu等[37]也發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，丙酮對(duì)多刺裸腹溞的繁殖具有促進(jìn)作用；推測(cè)其原因可能是細(xì)菌以丙酮為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)源，進(jìn)而為枝角類提供更多的食物。陳艷等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，0.5‰的丙酮對(duì)多刺裸腹溞F0生命表參數(shù)無(wú)顯著性影響，但卻顯著提高了F1代和F2代的種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，0.5‰的丙酮對(duì)多刺裸腹溞F0代的存活和生殖均無(wú)顯著性影響，但卻顯著縮短了多刺裸腹溞F1和F2代的首次生殖時(shí)間。

3.2 污染物濃度與浮游動(dòng)物生活史參數(shù)之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系

低污染物濃度范圍內(nèi)的劑量-反應(yīng)性質(zhì)一直是毒理學(xué)研究中最具挑戰(zhàn)的話題之一[38]。越來(lái)越多的證據(jù)表明這類劑量-反應(yīng)關(guān)系呈“U”形，表現(xiàn)為毒物刺激效應(yīng)(hormesis)，以“低促高抑”為特征[38]。低濃度的艾氏劑(aldrin)、十氯丹(chlordecone)和鄰苯二甲酸丁芐酯促進(jìn)萼花臂尾輪蟲的種群增長(zhǎng)[39-41]；1.0×106cells·mL-1的斜生柵藻密度下，6.0 μg·L-1的Hg2+促進(jìn)萼花臂尾輪蟲的存活、生殖和種群增長(zhǎng)[42]；一定濃度的艾氏劑促進(jìn)多刺裸腹溞F2代的種群增長(zhǎng)[27]。本研究中，毒物刺激效應(yīng)也是明顯的，主要表現(xiàn)為與對(duì)照組相比，暴露于0.02 μg·L-1的紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均壽命顯著延長(zhǎng)，暴露于0.2、20～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的首次生殖年齡顯著減小，暴露于20和200 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F1代的窩卵數(shù)和總后代數(shù)顯著增加。低濃度的污染物可能刺激了多刺裸腹溞的攝食，因此促進(jìn)了它的存活、發(fā)育和生殖；而高濃度的污染物可能減少了多刺裸腹溞的攝食，加之污染物的毒性作用，由此抑制了它的存活、發(fā)育和生殖。

Ji等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，21 d慢性毒性暴露后，暴露于100和300 mg·L-1紅霉素溶液中的大型溞的存活率顯著降低，暴露于33.3 mg·L-1紅霉素溶液中的大型溞的窩卵數(shù)和總后代數(shù)顯著減少，但暴露于3.7～33.3 mg·L-1紅霉素溶液中的大型溞的首次生殖時(shí)間未出現(xiàn)顯著性差異；暴露于400和1 600 μg·L-1紅霉素硫氰酸鹽溶液中的大型溞的壽命顯著縮短，暴露于1 600 μg·L-1紅霉素硫氰酸鹽溶液中的大型溞的首次生殖年齡顯著縮短，暴露于400、800和1 600 μg·L-1紅霉素硫氰酸鹽溶液中的大型溞的生殖窩數(shù)和總后代數(shù)顯著減少[17]；7 d慢性毒性暴露后，暴露于150 mg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞的存活率顯著降低；但暴露于1.85～50.0 mg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞的首次生殖時(shí)間、窩卵數(shù)和總后代數(shù)均無(wú)顯著變化[8]。由于慢性毒性試驗(yàn)持續(xù)的時(shí)間和測(cè)試的紅霉素濃度范圍等不同，本研究所得到的結(jié)果也與上述結(jié)果之間有所不同。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，暴露于0.02 μg·L-1紅霉素溶液中的多刺裸腹溞F0代的平均壽命顯著延長(zhǎng)了，但暴露于2～2 000 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的平均壽命顯著縮短；暴露于20 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的生殖窩數(shù)顯著減小，暴露于2～200 μg·L-1紅霉素溶液中的F0代的總后代數(shù)顯著減少。

3.3 污染物濃度對(duì)枝角類生活史參數(shù)影響的世代間差異

已有研究結(jié)果表明，枝角類的存活和生殖等對(duì)污染物的響應(yīng)因孤雌生殖世代數(shù)或窩數(shù)的不同而異。如21 d慢性毒性暴露后，大型溞的平均壽命、首次生殖年齡、生殖窩數(shù)、窩卵數(shù)和總后代數(shù)對(duì)二嗪農(nóng)濃度的響應(yīng)在F0代、F1代第1窩和第3窩個(gè)體間明顯不同[36]；完全生命周期慢性暴露后，多刺裸腹溞的生命期望和凈生殖率對(duì)升高的艾氏劑濃度的反應(yīng)以及平均壽命、首次生殖年齡和總后代數(shù)對(duì)升高的壬基酚濃度的反應(yīng)均在F0、F1和F2代之間存在著顯著的差異[27, 29]；一定濃度的鄰苯二甲酸丁芐酯使多刺裸腹溞F0代的生命期望和凈生殖率顯著降低，但對(duì)F1代卻無(wú)顯著性影響[28]；200.0 μg·L-1的氧氟沙星和900.0 μg·L-1的布洛芬對(duì)大型溞繁殖的影響表現(xiàn)出世代差異性[43]。與上述結(jié)果一致，本研究中，紅霉素濃度對(duì)多刺裸腹溞的平均壽命、首次生殖年齡、生殖窩數(shù)、窩卵數(shù)和總后代數(shù)的影響在多刺裸腹溞世代間也均存在著差異。

大型溞前幾代在生殖方面表現(xiàn)出對(duì)200.0 μg·L-1的氧氟沙星和900.0 μg·L-1的布洛芬一定的適應(yīng)性或耐受性[43]。本研究結(jié)果表明，多刺裸腹溞F1和F2代在存活、F2代在生殖等方面對(duì)各濃度的紅霉素也表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性或耐受性。當(dāng)然，更多世代的多刺裸腹溞對(duì)紅霉素污染的響應(yīng)仍需要進(jìn)一步的研究。