閆俐辰，王曉紅，趙元慧

東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春130117

隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的有機(jī)化合物被合成并釋放到環(huán)境中。這些化學(xué)品進(jìn)入環(huán)境后，對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染，并且對(duì)人類和環(huán)境中的生物造成極大的毒害作用。因此，世界各國(guó)對(duì)有機(jī)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)都極為關(guān)注[1]。近年來(lái)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)越來(lái)越受到重視，而農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中擔(dān)任著無(wú)比重要的角色，根據(jù)農(nóng)藥的作用不同可將農(nóng)藥分為除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺菌劑等。盡管在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用農(nóng)藥可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，但是不合理的農(nóng)藥施用會(huì)造成農(nóng)藥在環(huán)境中的殘留。農(nóng)藥經(jīng)漂移和徑流等途徑進(jìn)入到環(huán)境水體中，會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生一定的毒害作用。研究表明二嗪農(nóng)和敵草隆對(duì)斑馬魚(yú)早期生命階段均具有中等毒性，96 h-LC50值分別為6.5 mg L-1和4 mg L-1[2]。殺蟲(chóng)劑馬拉硫磷對(duì)藍(lán)綠藻的生長(zhǎng)具有一定的抑制效應(yīng)，在濃度為200 mg L-1時(shí)能夠長(zhǎng)期抑制其生長(zhǎng)[3]。呋喃丹和敵敵畏均能夠抑制月牙藻細(xì)胞生長(zhǎng)并改變其細(xì)胞形態(tài)[4]。許多農(nóng)藥對(duì)許多水生生物均具有較大的毒性效應(yīng)。

在水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中，研究有機(jī)污染物對(duì)水生生物的毒性作用模式至關(guān)重要[5]。Verhaar等[6]將有機(jī)污染物對(duì)水生生物的毒性作用模式分為麻醉型和反應(yīng)型2種類型。其中，麻醉型化合物包括基線化合物和弱惰性化合物；反應(yīng)型化合物包括非特殊反應(yīng)型化合物和特殊反應(yīng)型化合物。麻醉型化合物在整個(gè)毒性作用過(guò)程中不與有機(jī)體的各個(gè)靶位發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)。這類化合物通過(guò)與細(xì)胞膜的非特異性作用，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，其毒性取決于其透過(guò)生物膜的能力，因此麻醉型化合物的毒性與辛醇/水分配系數(shù)logKow具有很好的相關(guān)性[7-10]。弱惰性化合物普遍包含氫鍵供體，能夠與生物分子發(fā)生氫鍵作用，因此它們的毒性略高于基線化合物的毒性[11]。非特殊反應(yīng)型化合物具有特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，能夠與普遍存在于生物大分子的某些結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，這類化合物的毒性效應(yīng)較大。特殊反應(yīng)型化合物能與某些受體分子特異性結(jié)合，毒性通常較大，并且作用機(jī)制非常復(fù)雜。反應(yīng)型化合物的毒性通常明顯高于麻醉型化合物的毒性。研究表明，麻醉型化合物在魚(yú)體內(nèi)的臨界濃度在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)變化，接近于常數(shù)，并且與毒性暴露方式無(wú)關(guān)；而反應(yīng)型化合物能夠與生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致其體內(nèi)臨界濃度較低。盡管目前已有大量水生環(huán)境暴露的生物毒性數(shù)據(jù)，但是有機(jī)化合物在水中的濃度通常具有可變性，而在有機(jī)體靶位上的濃度是非常穩(wěn)定的，可以反映有機(jī)化合物在生物體內(nèi)的固有濃度[12]。因此，分析化合物在水生生物體內(nèi)的臨界濃度將有助于判斷化合物對(duì)水生生物的毒性作用機(jī)理。

大型溞是水環(huán)境中無(wú)脊椎浮游動(dòng)物的代表性生物，其以藻類為食，同時(shí)又是脊椎動(dòng)物的餌料。因此，大型溞在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中占據(jù)著重要的地位[13]。大型溞對(duì)多數(shù)毒性物質(zhì)很敏感，且繁殖周期短，分布廣泛，易于培養(yǎng)，因此普遍被應(yīng)用于化合物的毒性測(cè)試[14]。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了25種基線化合物對(duì)大型溞的急性毒性數(shù)據(jù)，并收集了57種農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的急性毒性數(shù)據(jù)，其中包括除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑。一方面，計(jì)算這25種基線化合物和57種農(nóng)藥類化合物在大型溞體內(nèi)的臨界濃度，將除草劑、殺菌劑和殺蟲(chóng)劑在大型溞體內(nèi)的臨界濃度與基線化合物進(jìn)行比較；另一方面，應(yīng)用各類農(nóng)藥化合物對(duì)大型溞的急性毒性數(shù)據(jù)和化合物分子描述符建立QSAR模型，并研究典型農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性作用機(jī)理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 基線化合物和農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的急性毒性數(shù)據(jù)

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲取了25種基線化合物對(duì)大型溞的急性毒性數(shù)據(jù)log1/EC50。受試生物大型溞(Daphniamagna)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。大型溞置于(22 ± 2) ℃，并保持每天14 h:10 h亮暗比培養(yǎng)。我們選取出生6～24 h后的大型溞進(jìn)行毒性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)中每種基線化合物設(shè)置5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)?；衔锉┞?8 h后檢查大型溞是否停止活動(dòng)，并根據(jù)化合物劑量效應(yīng)關(guān)系計(jì)算出化合物對(duì)大型溞的急性毒性值。25種基線化合物對(duì)大型溞的毒性數(shù)據(jù)log1/EC50、化合物CAS號(hào)、名稱、辛醇水分配系數(shù)、生物富集因子logBCF以及體內(nèi)臨界濃度log1/CBR列于表1。

另外，從文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了共計(jì)57種農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞(Daphniamagna)的毒性數(shù)據(jù)[15-19]，這些數(shù)據(jù)均通過(guò)相同的實(shí)驗(yàn)方法獲取，具有良好的可靠性和有效性，且部分化合物來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的毒性數(shù)據(jù)具有較高的重現(xiàn)性。毒性數(shù)據(jù)表示為L(zhǎng)C50(48 h半數(shù)致死濃度，單位為mol·L-1)或EC50(48 h半數(shù)活動(dòng)抑制濃度，單位為mol·L-1)。研究表明，化合物導(dǎo)致大型溞死亡和停止活動(dòng)的濃度十分接近[20]，因此本文將以大型溞死亡和停止運(yùn)動(dòng)為測(cè)試終點(diǎn)的毒性數(shù)據(jù)整理為同一數(shù)據(jù)集。57種農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性數(shù)據(jù)log1/EC50(log1/LC50)、化合物CAS號(hào)、名稱、辛醇水分配系數(shù)、生物富集因子logBCF以及體內(nèi)臨界濃度log1/CBR列于表1。

1.2 體內(nèi)臨界濃度的計(jì)算

體內(nèi)臨界濃度CBR是指在一定時(shí)間內(nèi)能夠引起50%生物死亡時(shí)化合物在生物體內(nèi)的濃度[21]。因此，如果在毒性實(shí)驗(yàn)中有機(jī)化合物在水相和生物相中達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)臨界濃度可以表示為公式(1)[22-24]。

CBR = LC50×BCF

(1)

式(1)中，BCF為生物富集因子，本文中生物富集因子通過(guò)文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的化合物在大型溞體內(nèi)的生物富集因子logBCF值與辛醇-水分配系數(shù)logKow的線性關(guān)系進(jìn)行計(jì)算[25]。LC50值應(yīng)用實(shí)測(cè)值或文獻(xiàn)中獲得的毒性數(shù)據(jù)。

1.3 分子描述符和統(tǒng)計(jì)分析

本文計(jì)算了20種分子結(jié)構(gòu)描述符，其中包括疏水性參數(shù)logKow，Abraham參數(shù)(A,B,E,S,V)，氫鍵供體、受體數(shù)量(NHD、NHA)以及量子化學(xué)參數(shù)最高占據(jù)分子軌道能量(EHOMO)、最低未占據(jù)分子軌道能量(ELUMO)等。我們應(yīng)用EPI Suite軟件計(jì)算化合物的辛醇水分配系數(shù)logKow；應(yīng)用Algorithm Builder軟件計(jì)算化合物的Abraham參數(shù)，氫鍵供體、受體數(shù)量等參數(shù)；應(yīng)用MOPAC軟件計(jì)算化合物的量子化學(xué)參數(shù)。20種分子描述符的名稱及其含義列于表2。

使用Minitab軟件對(duì)各農(nóng)藥的毒性數(shù)據(jù)和各分子描述符進(jìn)行多元線性回歸分析，每個(gè)公式給出化合物數(shù)量N、標(biāo)準(zhǔn)偏差S、相關(guān)系數(shù)R2以及Fisher檢驗(yàn)F值，以此評(píng)價(jià)公式的擬合程度和顯著性水平。

表1 基線化合物和農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的急性毒性、生物富集因子和體內(nèi)臨界濃度值Table 1 Toxicities of baseline and agricultural compounds to Daphnia magna, and their logBCF, logCBR values

表2 分子結(jié)構(gòu)描述符Table 2 Molecular descriptors

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 基線化合物對(duì)大型溞的毒性與辛醇/水分配系數(shù)的關(guān)系

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了25種基線化合物對(duì)大型溞的急性毒性。這些基線化合物包含烷烴類、酮類、醚類、苯及其鹵代衍生物。通過(guò)將基線化合物的毒性與化合物分子描述符進(jìn)行逐步回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)基線化合物的毒性與辛醇水分配系數(shù)logKow具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)公式如(2)所示：

log1/EC50= 1.30 + 0.918 logKow

(2)

N= 25S= 0.33R2= 0.90F= 212

通過(guò)比較公式的斜率和截距可以發(fā)現(xiàn)，該公式與文獻(xiàn)中報(bào)道的基線化合物對(duì)大型溞的急性毒性與logKow之間的線性關(guān)系十分接近(log1/EC50= 1.09 + 0.934logKow)[20]。這說(shuō)明本公式具有良好的可靠性，基線化合物對(duì)大型溞的急性毒性與logKow的關(guān)系見(jiàn)圖1。

2.2 農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性與化合物分子描述符的關(guān)系

根據(jù)公式(2)可知基線化合物對(duì)大型溞的毒性與logKow呈正比關(guān)系。然而，我們通過(guò)研究農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的急性毒性與logKow的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥類化合物的毒性與logKow具有較差的相關(guān)性(圖1)。逐步回歸分析表明，由于農(nóng)藥類化合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，應(yīng)用本文所計(jì)算的分子描述符未能建立擬合程度較高的QSAR模型。這表明農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性具有不同的毒性作用機(jī)理。我們將農(nóng)藥按照功能分為除草劑、殺菌劑和殺蟲(chóng)劑，應(yīng)用多元線性回歸分析分別建立了各類農(nóng)藥對(duì)大型溞的急性毒性與化合物分子描述符之間的關(guān)系(公式3～5)。這些分子描述符反映了化合物的多種性質(zhì)，如疏水性、電離性、親電性以及能否形成氫鍵等性質(zhì)。

除草劑：log1/EC50= 1.30 + 0.934 logKow+ 1.20F+(3)

N= 34S= 0.34R2= 0.92F= 173

殺菌劑：log1/EC50=1.37+0.814 logKow+0.000011Hf+0.0147 TPSA

(4)

N= 33S= 0.59R2= 0.82F= 43

殺蟲(chóng)劑：log1/EC50= 1.63 + 0.596 logKow- 0.426S+ 0.348V+ 1.93B+ 0.00663 CV

(5)

N= 65S= 0.91R2= 0.80F= 48

2.3 基于體內(nèi)臨界濃度比較基線和農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性作用機(jī)理

基線化合物與logKow的關(guān)系(公式2)可以通過(guò)體內(nèi)臨界濃度的概念來(lái)解釋。眾所周知，LC50是導(dǎo)致大型溞半數(shù)死亡時(shí)有機(jī)污染物在水相中的暴露濃度，其是體外濃度。目前普遍認(rèn)為描述有機(jī)污染物對(duì)生物真實(shí)毒性效應(yīng)的指標(biāo)應(yīng)該用體內(nèi)臨界濃度(CBR)。在理論上，如果實(shí)驗(yàn)中有機(jī)物在生物體內(nèi)能達(dá)到吸附平衡，體內(nèi)臨界濃度(CBR)與體外濃度(LC50)的關(guān)系可以通過(guò)生物富集因子(BCF)關(guān)聯(lián)起來(lái)[26]。

BCF = CBR/LC50

(6)

log1/LC50= log1/CBR + logBCF

(7)

研究表明，大型溞的logBCF與logKow間具有很好的線性關(guān)系[25]，即：

logBCF = 0.850 logKow- 1.100

(8)

將該公式帶入公式(7)中，即可得到有機(jī)化合物對(duì)大型溞的急性毒性與logKow之間的關(guān)系，如公式(9)所示：

log1/LC50= log 1/CBR + 0.850 logKow- 1.100

(9)

圖1 基線化合物和不同類型農(nóng)藥對(duì)大型溞的急性毒性與辛醇水分配系數(shù)logKow的關(guān)系Fig. 1 Relationships between log Kow and toxicities to Daphnia magna for baselines and pesticides

很多研究表明，基線化合物對(duì)水生生物是通過(guò)麻醉作用發(fā)揮毒性效應(yīng)，其在生物體內(nèi)的臨界濃度CBR值在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)變化，即接近于一個(gè)常數(shù)[20, 27]。我們通過(guò)公式(8)計(jì)算了25種基線化合物的logBCF值，然后通過(guò)公式(6)或(7)計(jì)算了這些基線化合物的CBR值。結(jié)果表明，除了丙酮外(CBR = 11.91 mmol·kg-1)，其他基線化合物在大型溞體內(nèi)的臨界濃度范圍為0.92～7.59 mmol·kg-1(圖2)。該范圍和文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中的基線化合物在魚(yú)體內(nèi)的臨界濃度范圍極為相近(2～8 mmol·kg-1)[28]，這說(shuō)明基線化合物對(duì)大型溞的毒性機(jī)理和對(duì)魚(yú)的毒性機(jī)理相同，大型溞的體內(nèi)臨界濃度CBR值同樣接近于一個(gè)常數(shù)，同時(shí)也說(shuō)明了為什么基線化合物對(duì)大型溞的毒性與logKow呈現(xiàn)正比關(guān)系(公式9)。

表1展示了根據(jù)公式(7)和(8)計(jì)算的25種基線化合物和57種農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的生物富集因子logBCF值和體內(nèi)臨界濃度log1/CBR值。計(jì)算結(jié)果表明，除草劑在大型溞體內(nèi)的臨界濃度CBR值范圍為0.08～3.30 mmol·kg-1；殺菌劑在大型溞體內(nèi)的臨界濃度CBR值范圍為0～0.16 mmol·kg-1；殺蟲(chóng)劑在大型溞體內(nèi)的臨界濃度CBR值范圍為0～1.10 mmol·kg-1。顯而易見(jiàn)，農(nóng)藥類化合物在大型溞體內(nèi)的殘余量范圍顯著低于基線化合物在大型溞體內(nèi)的殘余量。因此，大部分農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基線化合物，并且與大型溞生物分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。其中，除草劑對(duì)大型溞的毒性略低于殺菌劑和殺蟲(chóng)劑。圖2表明了基線化合物和各農(nóng)藥類化合物在大型溞體內(nèi)的臨界濃度log1/CBR與logKow的關(guān)系。通過(guò)圖2可以看出基線化合物在大型溞體內(nèi)的臨界濃度log1/CBR值在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)變化，從而使得基線化合物對(duì)大型溞的毒性值與logKow具有很好的線性關(guān)系。然而，對(duì)于農(nóng)藥類化合物，尤其是殺蟲(chóng)劑和殺菌劑，它們?cè)诖笮蜏畜w內(nèi)的臨界濃度log1/CBR值變化范圍很大，從而使得這些化合物的毒性值不僅與生物富集(logKow)有關(guān)，而且與它們?cè)谏矬w作用靶位上的濃度有關(guān)。

圖2 基線化合物和本文所研究的農(nóng)藥在大型溞體內(nèi)的臨界濃度與辛醇水分配系數(shù)的關(guān)系Fig. 2 Relationships between logKow and log CBR of Daphnia magna for baseline compounds and the studied agricultural chemicals

2.4 農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞的毒性作用機(jī)理

上述研究表明農(nóng)藥類化合物的log1/CBR值不是一個(gè)常數(shù)，在公式(9)中需要引入反應(yīng)性分子描述符，反映農(nóng)藥類化合物與生物受體間的化學(xué)反應(yīng)。除草劑多通過(guò)干擾植物光合作用、植物激素以及植物生物合成等機(jī)理發(fā)揮效應(yīng)，因而對(duì)大型溞的急性毒性作用機(jī)理較為簡(jiǎn)單。通過(guò)建立QSAR模型表明，除草劑對(duì)大型溞的毒性接近于基線毒性，但略高于基線毒性。公式(3)表明除草劑對(duì)大型溞的急性毒性主要取決于化合物從水相向生物相分配的能力。另外，除草劑對(duì)大型溞的急性毒性還與化合物的離子化程度有關(guān)，化合物的離子化程度越高，化合物對(duì)大型溞的急性毒性越高。離子化會(huì)引起化合物的生物富集能力降低，但是離子化合物所帶正電荷易與蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)[29]。殺菌劑多通過(guò)抑制菌體內(nèi)核酸或蛋白質(zhì)等生物大分子合成發(fā)揮作用，其對(duì)大型溞的急性毒性效應(yīng)主要與化合物的標(biāo)準(zhǔn)生成熱和極性表面積有關(guān)?；衔锏臉?biāo)準(zhǔn)生成熱和極性表面積越大，化合物對(duì)大型溞的急性毒性越大。公式(4)表明殺菌劑的穩(wěn)定性越低，其對(duì)大型溞的急性毒性越大[30]。另外，化合物的極性表面積多指氧原子或氮原子，這些原子具有較強(qiáng)的吸電子能力，且易于生物分子發(fā)生氫鍵作用。殺蟲(chóng)劑多通過(guò)抑制生物神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸作用和生殖機(jī)能發(fā)揮效應(yīng)[31]，大型溞是水環(huán)境中無(wú)脊椎動(dòng)物的代表性生物，其生理系統(tǒng)與植物生理系統(tǒng)相差較大，而與昆蟲(chóng)生理系統(tǒng)較為接近，這可能是殺蟲(chóng)劑對(duì)其毒性較高的原因。公式(5)表明殺蟲(chóng)劑對(duì)大型溞的急性毒性效應(yīng)與化合物的分子極性、分子體積、氫鍵堿度和科斯模體積有關(guān)?；衔锏姆肿訕O性越高，化合物對(duì)大型溞的急性毒性越低。盡管增加化合物的極性能夠增加化合物與靶位分子的結(jié)合能力[32]，但是化合物極性表面積過(guò)高能夠降低其向生物相分配的能力。另外，化合物的分子體積和科斯摩體積在一定程度上與其向生物相中分配的能力和與生物分子間的范德華力有關(guān)。殺蟲(chóng)劑對(duì)大型溞的毒性還與其氫鍵堿度有關(guān)，分子堿性越強(qiáng)毒性越高。根據(jù)公式(5)計(jì)算結(jié)果表明，這些殺蟲(chóng)劑對(duì)大型溞的毒性效應(yīng)與其和生物分子之間的氫鍵和范德華力有關(guān)。另外，盡管殺蟲(chóng)劑普遍對(duì)大型溞具有較高的毒性，但是仍然有一些疏水性較高的殺蟲(chóng)劑對(duì)大型溞的毒性接近基線毒性。一方面是由于高疏水性化合物在水中溶解度較低，從而導(dǎo)致其生物利用率降低；另一方面是由于高疏水性化合物對(duì)水生生物的毒性往往以麻醉性毒性為主，反應(yīng)性毒性為輔。

綜上所述：本文將農(nóng)藥類化合物和基線化合物對(duì)大型溞的毒性作用機(jī)理進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)農(nóng)藥類化合物對(duì)大型溞為反應(yīng)性毒性作用模式，不同類別的農(nóng)藥對(duì)大型溞的毒性作用機(jī)理不同。其中，除草劑的毒性顯著低于殺菌劑和殺蟲(chóng)劑的毒性。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用必不可少，其在生產(chǎn)和使用過(guò)程中能夠?qū)θ祟惣碍h(huán)境中的生物產(chǎn)生毒害作用。因此，研究農(nóng)藥類化合物對(duì)水生生物的毒性作用機(jī)理對(duì)于今后農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用具有一定的參考價(jià)值。未來(lái)我們會(huì)通過(guò)測(cè)定農(nóng)藥在生物體內(nèi)的濃度變化進(jìn)行典型農(nóng)藥類化合物在生物體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)研究。