鄒麗娜，戴玉霞，邱偉迪，張 舒，趙佳偉，唐先進(jìn)*，施積炎，徐建明

（1.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，杭州 310058；2.上?？启釞z驗(yàn)技術(shù)有限公司，上海 200123；3.浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，杭州310032）

砷（As）是環(huán)境中無(wú)處不在的有毒類(lèi)金屬。土壤中的As主要是由地質(zhì)和人為活動(dòng)產(chǎn)生，人類(lèi)活動(dòng)包括金屬開(kāi)采和冶煉，含As農(nóng)藥、除草劑、木材防腐劑、食品添加劑等的使用，以及As污染水灌溉。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）將As列為有效的人類(lèi)致癌物，并且是造成嚴(yán)重健康問(wèn)題的主要原因[1-2]。糧食作物，特別是水稻，是世界上一半人口的主食，也是As的主要來(lái)源[3-4]。在孟加拉國(guó)、印度、中國(guó)、韓國(guó)和泰國(guó)等亞洲國(guó)家，由于水稻具有從土壤和灌溉用水中吸收As的特殊能力，而使從大米飲食中攝入As的量顯著增加[5-7]。因此，As從土壤遷移到植物系統(tǒng)是一個(gè)值得關(guān)注的嚴(yán)重問(wèn)題。

硫（S）是土壤中重要的生源要素，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育方面扮演著重要角色。近年來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)土壤缺S逐漸嚴(yán)重，硫素成為繼氮、磷、鉀之后的第四大肥料，在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用逐漸被重視[8]。硫進(jìn)入稻田土壤后可以影響土壤氧化還原電位（Eh）、pH等，主要是由于無(wú)機(jī)硫從-2價(jià)到+6價(jià)的氧化還原狀態(tài)的改變[9]，進(jìn)而影響重金屬的氧化還原過(guò)程。硫素添加對(duì)環(huán)境中As的遷移轉(zhuǎn)化的影響目前已有一些研究。有研究表明，地下水中硫酸鹽還原產(chǎn)生的硫化物可以固定As或者與鐵共同作用固定As，表明硫酸鹽可以有效調(diào)控地下水的As污染[10]。Li等[11]利用同位素分析發(fā)現(xiàn)地下水中硫酸鹽和As濃度具有較好的相關(guān)關(guān)系，推斷硫酸鹽在As的形態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。在稻田土壤中，由于存在豐富的鐵（Fe），S、Fe和As的生物地球化學(xué)循環(huán)更為復(fù)雜[12]。有研究對(duì)不同濃度水溶態(tài)Fe、As條件下，F(xiàn)eS及As2S3存在比例進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，As可以與H2S形成As2S3沉淀，而當(dāng)溶液中的Fe2+濃度較高時(shí)，可以將產(chǎn)生的H2S消耗掉，從而減少As與H2S之間的反應(yīng)[13]。此外，S和Fe的氧化還原產(chǎn)物也會(huì)介導(dǎo)非生物的As氧化還原。因此，S、Fe存在的情況下，As的形態(tài)及移動(dòng)性受到了很多因素的影響，其化學(xué)及微生物機(jī)制由于其復(fù)雜性并沒(méi)有完全清楚。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)添加As污染土壤施加硫素，采集全生育期土壤溶液和成熟期水稻植株樣品，分析硫素添加對(duì)As移動(dòng)性及生物有效性的影響，最終考察硫素添加對(duì)水稻吸收和累積As的影響。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)供試土壤為添加As的污染土，土壤采自浙江省湖州市安吉縣水稻土表層（0～20 cm），該土壤本底As濃度為（20.26±2.15）mg·kg-1。在土壤中添加50 mg·kg-1的As（以Na3AsO4的形式），采用噴霧法將Na3AsO4·12H2O溶液噴灑至土壤中，使得重金屬溶液與土壤混合均勻，保持20%的添加水量，再將土壤放至人工氣候室（相對(duì)濕度60%～70%，白天25℃16 h，夜晚20℃8 h）老化一個(gè)月，保持恒定的濕度和溫度，經(jīng)老化后的土壤待用。土壤為粉砂質(zhì)粘壤土，老化后土壤的pH 4.83，有機(jī)質(zhì) 5.23%，總As 69.01 mg·kg-1，總Fe 22.5 g·kg-1。

本試驗(yàn)采用聚氯乙烯（PVC）桶（高30 cm×直徑13 cm）進(jìn)行水稻種植，每個(gè)桶中裝有一個(gè)根際袋（300目，高15 cm×直徑8 cm），用于區(qū)分根際與非根際土壤。每桶土稱(chēng)重2.5 kg（以干重記）。設(shè)3種硫素處理：對(duì)照（CK）、單質(zhì)硫（S）、硫酸鈉（NS），添加濃度為0、50、150 mg·kg-1，以 CK、50S、150S、50NS及 150NS表示。硫素以固體形式在培養(yǎng)最初采用逐級(jí)擴(kuò)大法添加在土壤中，充分混勻后裝入種植桶。每種施肥處理均分別設(shè)置不種苗對(duì)照及滅菌對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。滅菌處理中添加了0.07%的NaN3溶液，NaN3作為一種呼吸抑制劑可以抑制微生物活動(dòng)。在每個(gè)桶的中部土壤5 cm深處分別埋入一個(gè)自制的土壤溶液采樣器，包括一根硅膠軟管，底部連接一個(gè)白玉氣石，培養(yǎng)示意圖如圖1。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持采樣器位置不動(dòng)，從而保證無(wú)擾動(dòng)的原位采樣。種植水稻的處理在根際袋中埋入自制土壤溶液采樣器。全部處理安裝完成后，在土壤中添加了含底肥的去離子水，底肥氮磷鉀的施入量分別為P2O5[Ca（H2PO4）2]0.5 g·kg-1，N[CO（NH2）2]和 K2O（KCl）各0.2 g·kg-1。保持淹水高度約5 cm。待處理平衡一周后，進(jìn)行水稻幼苗的移栽，并且每天補(bǔ)充水分。

1.2 水稻植株培養(yǎng)與樣品采集

水稻植株培養(yǎng)：水稻種子采用中早39號(hào)（浙江省勿忘農(nóng)集團(tuán)有限公司），用自來(lái)水沖洗后，去除空殼，將剩余的種子于30%H2O2中消毒15 min，然后用去離子水洗凈。將種子置于濕潤(rùn)的紗布上進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽?jī)芍芎筇暨x長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)挠酌绶湃霠I(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)。在人工氣候室中培養(yǎng)3周后，進(jìn)行水稻移栽。

圖1 水稻培養(yǎng)示意圖Figure 1 Diagram of rice cultivation

土壤溶液采集：根據(jù)實(shí)驗(yàn)采用蠕動(dòng)泵進(jìn)行分段采樣，采集的土壤溶液過(guò)0.45 μm的濾膜，每采集9 mL土壤溶液，加入1 mL 0.5 mol·L-1的鹽酸溶液，以酸化土壤溶液。取樣時(shí)間為一周一次，持續(xù)采集10周，并將采集液立刻避光冷藏，-20℃冰箱保存，防止高溫下土壤溶液中的物質(zhì)氧化。

土壤采集：小心地取出根際袋，取下粘附在根上的土壤作為根際土。無(wú)植物處理作為非根際土，滅菌處理作為無(wú)生物對(duì)照。避開(kāi)土壤溶液取樣器所在位置。先取一袋土，在自封袋中混合均勻后，分成兩份，置于-70℃冰箱待測(cè)。

水稻樣品采集：收獲水稻根、莖、葉、穗。水稻根部用自來(lái)水將泥土沖洗干凈后再用去離子水洗凈。水稻生長(zhǎng)特征測(cè)量包括生物量、植物株高。將水稻用吸水紙擦去表面水后測(cè)量鮮重。用毫米尺測(cè)量水稻株高。用不銹鋼剪刀將水稻分成根、莖、葉、穗幾部分，于-70℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 樣品分析

土壤溶液中的Fe：在采集土壤溶液的同時(shí)，迅速取適量過(guò)0.45 μm濾膜的土壤溶液，采用鄰菲羅啉比色法進(jìn)行Fe（Ⅱ）的測(cè)定。分別加入5 mL 1 mol·L-1的乙酸鈉及0.1%的鄰菲羅啉溶液，顯色30 min后定容至50 mL，在510 nm吸光度下測(cè)定。在溶液中加入10%鹽酸羥胺溶液，顯色定容測(cè)定總Fe，以此得到Fe（Ⅲ）含量。

土壤溶液中的As：采用原子熒光分光光度計(jì)法（AFS-9130，Beijing Jitian Instrument Company，China）測(cè)定土壤溶液中的總As。分別選取幼苗期（2W）、分蘗期（4W）、抽穗期（7W）、成熟期（10W）的土壤溶液進(jìn)行As形態(tài)的測(cè)定。利用高效液相色譜與電感耦合等離子質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS NEXION300XX，PerkinElmer，Inc.，USA）進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相為 8 mmol·L-1（NH4）2HPO4和 8 mmol·L-1NH4NO3（pH=6.2）的緩沖溶液。

土壤中As的連續(xù)提?。篈s連續(xù)提取方法主要用于提取非專(zhuān)性吸附態(tài)（F1）、專(zhuān)性吸附態(tài)（F2）、無(wú)定形鐵氧化物態(tài)（F3）、晶體鐵氧化物態(tài)（F4）及殘?jiān)鼞B(tài)（F5）As[14]。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g冷凍干燥后過(guò)100目篩的土壤于50 mL離心管中，具體操作如表1。提取后，采用原子熒光分光光度計(jì)測(cè)定不同As形態(tài)的含量。

根表膠膜提取液：根表膠膜采用ACA法進(jìn)行提取[15]。稱(chēng)取適量鮮根，分別放入100 mL錐形瓶，向錐形瓶中加入ACA溶液，包括40 mL 0.3 mol·L-1檸檬酸鈉、5 mL 10%乙酸鈉及3 g抗壞血酸。在室溫下（20～25℃）低速振蕩3 h，將浸提液定容到100 mL容量瓶中，并用去離子水沖洗根3次，過(guò)濾待測(cè)。采用ICPOES（Icap 6300，Thermo，USA）進(jìn)行 As、Fe和 S的測(cè)定。浸提后的根105℃殺青30 min，65℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)干質(zhì)量。將水稻根研磨后待用。

植物樣品中的總As：將冷凍干燥后的各部分植物磨成粉末，稱(chēng)取0.2 g植物樣品于聚四氟乙烯消解管中，分別加入 5 mL HNO3、1 mL HF和 1 mL 30%H2O2，采用微波消解儀（MARS6，CEM Microwave Technology Ltd.，USA）進(jìn)行消解，消解程序如下：1600 W條件下通過(guò)15 min加熱至210℃，在此溫度下保持30 min，然后15 min降溫。消解的樣品采用去離子水定容至25 mL，過(guò)濾后采用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS NEXION300XX，PerkinElmer，Inc.，USA）測(cè)定As含量。加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW07603（GSV-2）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心]進(jìn)行消解質(zhì)量控制，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的As含量為（1.25±0.15）mg·kg-1，分析得到的As含量為（1.32±0.01）mg·kg-1。

表1 土壤As連續(xù)提取方法操作步驟Table 1 Sequential fractionation scheme of As

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），處理樣品以及對(duì)照中不同數(shù)值之間的顯著性差異分析通過(guò)Least significant difference（LSD）檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。圖表中的數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形態(tài)硫素對(duì)土壤溶液中Fe的影響

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有處理均未檢出Fe（Ⅲ）。在土壤溶液中，淹水開(kāi)始的前3周，F(xiàn)e（Ⅱ）濃度在所有處理中都呈上升趨勢(shì)。圖2A顯示了5個(gè)處理下根際土壤溶液中Fe（Ⅱ）濃度的變化。根際土壤溶液中Fe（Ⅱ）的濃度變化可以分為3個(gè)階段：前3周Fe（Ⅱ）的濃度有一定程度的增加；3～5周時(shí)Fe（Ⅱ）濃度降低；5～10周為穩(wěn)定階段。從第3周開(kāi)始，CK處理土壤溶液中的Fe（Ⅱ）相對(duì)其他處理均較高，不同形態(tài)硫素的添加降低了根際土壤溶液中Fe（Ⅱ）的濃度。結(jié)合圖3A發(fā)現(xiàn)，從分蘗期（4W）開(kāi)始，隨著硫素的添加，F(xiàn)e（Ⅱ）均有一定程度的降低，抽穗期（7W）時(shí)，硫素添加均顯著降低了土壤溶液中Fe（Ⅱ）的濃度。成熟期（10W）硫酸鈉的添加顯著降低土壤溶液中的Fe（Ⅱ）。圖2B顯示了非根際土壤中Fe（Ⅱ）濃度的變化。與根際土壤溶液類(lèi)似，非根際土壤前3周Fe（Ⅱ）的濃度有一定程度的增加；隨后Fe（Ⅱ）濃度呈現(xiàn)一個(gè)曲折下降的過(guò)程，并趨于平穩(wěn)。5周以后，50NS及150NS處理下Fe（Ⅱ）均低于CK處理，而50S及150S處理仍與CK處理相似。結(jié)合圖3B可以看出，幼苗期（2W）和分蘗期（4W）硫素的添加均對(duì)Fe（Ⅱ）的濃度沒(méi)有顯著影響，而隨著淹水時(shí)間的增加，不同濃度硫酸鈉的添加顯著降低了土壤溶液中Fe（Ⅱ）的含量，并且濃度越高，影響越大?？傮w來(lái)說(shuō)，土壤溶液根際非根際變化趨勢(shì)類(lèi)似。圖2C顯示了滅菌處理土壤溶液中Fe（Ⅱ）的變化趨勢(shì)，與不滅菌處理相比，呈現(xiàn)較大的差異。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，前期土壤溶液中的Fe（Ⅱ）濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而在最后階段處于穩(wěn)定趨勢(shì)。結(jié)合圖3C可以發(fā)現(xiàn)，不同形態(tài)的硫素在滅菌處理下，變化趨勢(shì)有一些差別。相比CK來(lái)說(shuō)，150S處理Fe（Ⅱ）濃度先上升后下降，而150NS處理Fe（Ⅱ）濃度先下降后上升。

2.2 不同形態(tài)硫素對(duì)土壤溶液中As的影響

圖2 整個(gè)水稻生長(zhǎng)過(guò)程土壤溶液中溶解態(tài)Fe（Ⅱ）的變化（A：根際；B：非根際；C：滅菌）Figure 2 The Fe（Ⅱ）concentration of soil pore water under different treatments（A：rhizosphere，B：bulk，C：sterilization）

整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期土壤溶液中根際、非根際、滅菌處理溶解態(tài)As的變化如圖4所示。根際土壤溶液各個(gè)處理變化較不同，整個(gè)過(guò)程呈波動(dòng)變化（圖4A）。CK處理大致呈現(xiàn)先減少后增加并逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)。硫素的添加均在一定程度上降低了土壤溶液中總As的含量，其中50S與CK的變化趨勢(shì)相似，而其他處理呈現(xiàn)大致的先減少后上升再減少的趨勢(shì)。結(jié)合圖5A可以發(fā)現(xiàn)，150S處理在4個(gè)不同時(shí)期均顯著降低了土壤溶液中的溶解態(tài)As。幼苗期后，硫素的添加顯著降低了土壤溶液中的溶解態(tài)總As，并且150 mg·kg-1的添加量與50 mg·kg-1相比顯著降低，存在一個(gè)劑量效應(yīng)。圖4B顯示了非根際土壤溶液中As的變化，CK處理呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，硫素添加后一定程度上降低了非根際土壤溶液中溶解態(tài)As的濃度。硫素添加的處理呈現(xiàn)先降低，隨后升高，后期又降低的趨勢(shì)。結(jié)合圖5B，在幼苗期和成熟期，硫素的添加并沒(méi)有顯著影響As，而在中間時(shí)期（分蘗期和抽穗期），硫素的添加顯著降低了土壤溶液中的As?？傮w來(lái)說(shuō)，非根際土壤溶液中的總As稍高于根際土。滅菌處理下的As與Fe（Ⅱ）的變化趨勢(shì)一致，呈顯著上升的趨勢(shì)（圖4C），硫素的添加反而在抽穗期顯著增加了土壤溶液中的As（圖5C）。

圖3 土壤溶液中不同生育期Fe（Ⅱ）的變化（A：根際；B：非根際；C：滅菌）Figure 3 The Fe（Ⅱ）concentration of soil pore water under different treatments during the rice growing stage（A：rhizosphere，B：bulk，C：sterilization）

在植物種植過(guò)程中，植物優(yōu)先選擇吸收土壤溶液中游離態(tài)的As，并且不同形態(tài)As對(duì)植物造成的毒害不同，所以土壤溶液中As的含量和形態(tài)反映了其對(duì)植物的有效性和毒性，在一定程度上決定了As在植物中的累積。在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了4個(gè)不同生育期土壤溶液中的As形態(tài)，As（Ⅲ）和As（V）的含量隨著生育期的延續(xù)呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。圖6顯示了根際、非根際及滅菌處理中的As形態(tài)變化。根際、非根際環(huán)境下，不同處理均主要以As（Ⅲ）為主，其含量達(dá)到了總As的75.7%～93.5%。如圖6A所示，根際土壤溶液中，硫素對(duì)As（Ⅲ）的影響與對(duì)總As的影響類(lèi)似，在幼苗期后，高濃度單質(zhì)硫和硫酸鈉的添加顯著降低了土壤溶液中的As（Ⅲ）。硫素的添加在水稻生長(zhǎng)前期降低了土壤溶液中As（Ⅴ）的濃度，而在水稻生長(zhǎng)后期影響減小。根際土壤溶液中的有機(jī)As占總As的1.5%～12.8%，硫素的添加一定程度上促進(jìn)了As（Ⅲ）向As（Ⅴ）和有機(jī)As的轉(zhuǎn)化。非根際土壤溶液中，As形態(tài)變化與根際土壤溶液相似（圖6B）。所有處理幼苗期As（Ⅲ）的占比均高于其他時(shí)期，在低硫處理時(shí)（50 mg·kg-1），隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，As（Ⅲ）的占比呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，而高硫處理時(shí)（150 mg·kg-1），As（Ⅲ）呈下降趨勢(shì)。2周后，有機(jī)As的含量有一定的上升。滅菌處理中，2周時(shí)土壤溶液中的As濃度較低，主要以As（Ⅴ）為主，并且基本沒(méi)有有機(jī)As出現(xiàn)（圖6C）；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，土壤溶液中As（Ⅲ）的含量逐漸增加，到10周時(shí)各個(gè)處理中As（Ⅲ）均達(dá)到94%，有機(jī)As也有一些出現(xiàn)。硫素處理在滅菌條件下對(duì)土壤溶液中As形態(tài)的變化影響較小。

圖4 整個(gè)水稻生長(zhǎng)過(guò)程土壤溶液中溶解態(tài)總As的變化（A：根際；B：非根際；C：滅菌）Figure 4 The total As concentration of soil pore water under different treatments（A：rhizosphere，B：bulk，C：sterilization）

2.3 不同形態(tài)硫素對(duì)土壤As化學(xué)形態(tài)的影響

不同硫素處理下，土壤五步提取As含量及其比例如圖7所示。因供試土壤為添加As的污染土壤，大部分的As主要以非專(zhuān)性吸附態(tài)、專(zhuān)性吸附態(tài)、無(wú)定形鐵氧化物態(tài)的形式存在，約占總As的70%左右（圖7）。其中無(wú)定型鐵氧化物態(tài)As占總As的比例最高，大約在30.3%～43.9%。在根際土壤中（圖7A和圖7B），50S處理下土壤As化學(xué)形態(tài)變化較小，而150S、50NS及150NS處理下，土壤中的非專(zhuān)性吸附態(tài)、專(zhuān)性吸附態(tài)、無(wú)定形鐵氧化物態(tài)、晶體鐵氧化物態(tài)As均顯著降低，而殘?jiān)鼞B(tài)As顯著升高，表明在根際土壤中，硫素的添加降低了生物有效性利用度較高的幾種形態(tài)，促進(jìn)了As向穩(wěn)定態(tài)的轉(zhuǎn)化。在非根際土壤中（圖7C和圖7D），硫素的添加一定程度降低了土壤中的非專(zhuān)性吸附態(tài)、專(zhuān)性吸附態(tài)As和殘?jiān)鼞B(tài)As，顯著增加了無(wú)定形鐵氧化物態(tài)、晶體鐵氧化物態(tài)As。與根際土壤相比，硫素的添加一定程度活化了殘?jiān)鼞B(tài)As，使其向無(wú)定形鐵氧化物態(tài)、晶體鐵氧化物態(tài)As轉(zhuǎn)化。在滅菌土壤中（圖7E和圖7F），隨著硫素的添加，非專(zhuān)性吸附態(tài)As顯著增加，這與根際、非根際土壤的變化趨勢(shì)相反，專(zhuān)性吸附態(tài)As顯著降低。低濃度硫素的添加降低了無(wú)定形鐵氧化物態(tài)，而高濃度與CK類(lèi)似。

2.4 不同形態(tài)硫素對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響

硫素添加對(duì)水稻生長(zhǎng)具有一定的影響（圖8）。圖8A顯示了硫素添加對(duì)水稻株高的影響，可以看出，硫素的添加對(duì)水稻地下部分的株高沒(méi)有顯著影響，而地上部分的高度均顯著增加，150S和150NS處理分別使水稻地上部分的高度比CK增加了18.3%和10.7%，一定程度上促進(jìn)了水稻地上部分的增長(zhǎng)。硫素的添加對(duì)水稻鮮重具有一定的促進(jìn)作用（圖8B）。低濃度硫素的添加沒(méi)有顯著影響水稻根的鮮重，而高濃度硫素的添加顯著增加了水稻根的鮮重，分別增加了31.6%（150S）和21.2%（150NS）。對(duì)水稻地上部鮮重來(lái)說(shuō)，低濃度的硫素有一定的促進(jìn)作用但沒(méi)有達(dá)到顯著水平，而高濃度硫素的添加顯著增加了地上部鮮重，分別增加了18.5%（150S）和26.3%（150NS）。硫素的添加也顯著增加了稻谷的產(chǎn)量。

圖5土壤溶液中不同生育期總As的變化（A：根際；B：非根際；C：滅菌）Figure 5 The total As concentration of soil pore water under different treatments during the rice growing stage（A：rhizosphere，B：bulk，C：sterilization）

2.5 水稻不同部位對(duì)As的累積

圖9 為不同土壤中硫素添加后水稻各部位中As累積的情況。在所有處理中，水稻根部的As含量最高。不同部位水稻As的累積量排序大致為根＞葉＞莖＞谷殼＞米粒。硫素添加對(duì)水稻根As的累積沒(méi)有顯著影響。單質(zhì)硫的添加顯著降低了水稻莖中As的累積，降低了28.8%（150S），而硫酸鈉的添加沒(méi)有顯著影響。硫素添加顯著降低了水稻葉中As的累積，并且硫酸鈉的添加使水稻葉和莖的累積量發(fā)生了改變，CK處理中葉＞莖，而硫酸鈉處理中葉≈莖。硫素的添加并沒(méi)有對(duì)谷殼中的As產(chǎn)生影響。高濃度硫素的添加顯著增加了水稻米粒中的As，高濃度的硫素處理下，水稻米粒中的As均達(dá)到1.72 mg·kg-1。

圖6 土壤溶液中不同生育期As形態(tài)的變化（A：根際；B：非根際；C：滅菌）Figure 6 The As species of soil pore water under different treatments during the rice growing stage（A：rhizosphere，B：bulk，C：sterilization）

2.6 不同處理下水稻根表膠膜元素含量

根表膠膜采用ACA提取法進(jìn)行提取，根表膠膜提取液中As、Fe和S的含量如表2所示。單質(zhì)硫的添加顯著增加了根表膠膜ACA提取態(tài)Fe的含量，硫酸鈉的添加增加了ACA提取態(tài)Fe的含量但沒(méi)有達(dá)到顯著水平。不同硫素的添加均顯著增加了ACA提取態(tài)As，根據(jù)表3可以發(fā)現(xiàn)，水稻根表膠膜ACA提取態(tài)As和ACA提取態(tài)Fe呈極顯著正相關(guān)（r=0.831，P＜0.01）。硫素的添加顯著增加了根表膠膜中的ACA提取態(tài)S，并且ACA提取態(tài)S與ACA提取態(tài)As（r=0.818，P＜0.01）和ACA提取態(tài)Fe（r=0.865，P＜0.01）均呈極顯著正相關(guān)。

圖7 不同形態(tài)硫素對(duì)不同處理土壤As化學(xué)形態(tài)的影響（A：根際砷含量；B：根際比例圖；C：非根際砷含量；D：非根際比例圖；E：滅菌砷含量；F：滅菌比例圖）Figure 7 Distribution of As fractions in soil treated with different S（A：rhizosphere As concentration，B：rhizosphere As percentage，C：bulk As concentration，D：bulk As percentage，E：sterilization As concentration，F(xiàn)：sterilization As percentage）

2.7 相關(guān)關(guān)系分析

將根際土壤溶液、根際土壤化學(xué)形態(tài)與水稻吸收As進(jìn)行相關(guān)性分析，考察影響水稻As吸收的因素。如表3所示，根表膠膜中的ACA提取態(tài)Fe和ACA提取態(tài)S均與水稻葉片中的As顯著負(fù)相關(guān)。土壤溶液中的As也與水稻As吸收有一定的相關(guān)關(guān)系，土壤溶液中的總As與水稻米粒中的As顯著負(fù)相關(guān)，As（Ⅲ）與水稻莖和葉中的As顯著正相關(guān)。土壤中As的化學(xué)形態(tài)與水稻吸收As及土壤溶液中As和Fe（Ⅱ）的移動(dòng)性也具有一定的顯著相關(guān)關(guān)系。

圖8 不同形態(tài)硫素對(duì)水稻株高和鮮質(zhì)量的影響（A：水稻株高；B：水稻鮮重）Figure 8 The length and fresh weight of rice plant treated with different S（A：length，B：fresh weight）

圖9 不同形態(tài)硫素對(duì)水稻不同部位As的影響Figure 9 As accumulation in different part of rice plant treated with different S

3 討論

在添加As的污染土壤中，水稻培養(yǎng)初期，土壤溶液中的Fe（Ⅱ）濃度無(wú)論是滅菌還是不滅菌都有一個(gè)增加的過(guò)程，可能是土壤淹水后Eh降低造成的Fe還原溶出，這是一個(gè)非生物因素主導(dǎo)的過(guò)程。當(dāng)最初還原釋放的Fe（Ⅱ）達(dá)到一定濃度時(shí)又被氧化形成礦物沉積，或者與土壤溶液中的還原態(tài)S沉淀固定，在水稻土中形成一個(gè)鐵的氧化還原循環(huán)。而滅菌處理中，F(xiàn)e（Ⅱ）不斷升高最終穩(wěn)定，是土壤中的Fe還原溶出的過(guò)程。與非根際相比，相同處理下根際土壤溶液中的Fe（Ⅱ）濃度更低，可能是根際富氧環(huán)境進(jìn)一步抑制了Fe還原，促進(jìn)了根表膠膜的形成。硫素的添加不同程度降低了土壤溶液中的Fe（Ⅱ）。在土壤溶液中，F(xiàn)e（Ⅲ）和SO2-4競(jìng)爭(zhēng)電子受體，雖然Fe（Ⅲ）的氧化還原電位略大于SO2-4[16]，但Fe（Ⅲ）主要以鐵礦物的形式存在，減少了與微生物的接觸，而硫素的添加使土壤溶液中SO2-4的濃度增加，因此SO2-4的電子競(jìng)爭(zhēng)能力稍強(qiáng)[17]。

水稻種植的前6周滅菌處理中溶出的As均較低，而非滅菌處理As濃度較高，表明這個(gè)過(guò)程是微生物介導(dǎo)的As還原溶出過(guò)程。而后隨著淹水時(shí)間的增加，滅菌條件下添加的As開(kāi)始溶出，這與Fe（Ⅱ）的變化趨勢(shì)是一致的。一方面可能是非生物作用的Fe還原溶出釋放了吸附的As，另一方面可能是隨著時(shí)間的增加，滅菌效果降低，從而導(dǎo)致微生物介導(dǎo)的As溶出。根際土壤溶液中的As整體低于非根際，一方面是由于水稻對(duì)土壤溶液中As的吸收，另一方面可能是根際富氧環(huán)境促進(jìn)了As氧化，使其沉淀固定。硫素的添加與Fe（Ⅱ）的變化規(guī)律類(lèi)似，也不同程度降低了土壤溶液中的As，特別是硫酸鈉的添加，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似。Jia等[18]發(fā)現(xiàn)淹水稻田土壤中硫酸鹽的添加降低了土壤溶液中的As。高濃度硫酸鹽的添加降低了土壤溶液中的As[13]?？赡苁橇蛩猁}的還原限制了水溶態(tài)As的累積[19]。Fe和S的氧化還原轉(zhuǎn)化可以形成次級(jí)礦物[如Fe（Ⅱ）和Fe（Ⅲ）氫氧化物、FeAsO4、FeS、As2S3]，將溶液中的As固定，硫化物通過(guò)還原含As的鐵氧化物，產(chǎn)生氧化態(tài)S和可溶解的Fe（Ⅱ），并釋放出As[19]。這部分釋放出的As又將被重新吸附形成新的鐵礦物，或形成As-S復(fù)合物，從而降低As的移動(dòng)性[20]。單質(zhì)硫處理與硫酸鈉處理的主要差別在于相同添加濃度下，硫酸鈉處理中的濃度更高，單質(zhì)硫向的轉(zhuǎn)化需要較長(zhǎng)的時(shí)間[9]，因此硫酸鈉處理降低效果更顯著。

表2 不同形態(tài)硫素對(duì)水稻根表膠膜元素（As、Fe、S）的影響Figure 2 ACA-extractable As，F(xiàn)e，S concentrations in root plaque on root surface treated with different S

表3 根際土壤溶液不同元素及根際土壤As化學(xué)形態(tài)與水稻吸收As的相關(guān)關(guān)系（皮爾森分析）Figure 3 Correlation coefficient among pore water As and Fe in rhizosphere，As fractions in rhizosphere soil and As accumulation in rice plant under different treatments（Pearson Correlation）

在淹水條件下，土壤具有厭氧、氧化還原電位低等特點(diǎn)，土壤溶液中的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）及少量甲基砷同時(shí)存在，并且以As（Ⅲ）為主[21]。土壤溶液中的As和Fe（Ⅱ）呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.549，P＜0.05），表明Fe（Ⅲ）和As（Ⅴ）還原促進(jìn)了土壤中As（Ⅲ）的釋放。在我們的研究中，硫素的添加一定程度上降低了根際、非根際土壤溶液中的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）。一方面可能是硫素的添加促進(jìn)了硫鐵礦物的形成，增加了其對(duì)As（Ⅴ）的吸附，另一方面大量As（Ⅲ）的存在可能與還原態(tài)S形成砷硫化物。這與土壤溶液中Fe（Ⅱ）、As（Ⅲ）濃度及pH有關(guān)，F(xiàn)e（Ⅱ）和土壤中的As競(jìng)爭(zhēng)微生物硫還原產(chǎn)生的H2S，F(xiàn)e（Ⅱ）濃度較高時(shí)會(huì)先與S還原產(chǎn)生的H2S反應(yīng)，形成硫鐵化合物[13]。土壤溶液中的As（Ⅲ）、Fe（Ⅱ）及硫化物的含量與吸附As的Fe（Ⅲ）氫氧化物的還原溶解速率及硫酸鹽還原速率有關(guān)，并且都是由微生物介導(dǎo)的[22]。相關(guān)微生物的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

土壤中的總As并不能代表土壤中As的有效性，因此采用順序提取方法來(lái)衡量As在土壤中的有效性[14]。在土壤中，非專(zhuān)性吸附態(tài)、無(wú)定型鐵氧化物態(tài)和晶體鐵氧化物態(tài)As均與土壤溶液中的Fe（Ⅱ）顯著正相關(guān)，其中晶體鐵氧化物態(tài)As與土壤溶液中的As也顯著正相關(guān)，表明這些形態(tài)在培養(yǎng)過(guò)程中并不穩(wěn)定，是Fe還原溶解的主要部分，而殘?jiān)鼞B(tài)As與土壤溶液中的As和Fe（Ⅱ）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明在添加As的污染土壤中僅殘?jiān)鼞B(tài)為As穩(wěn)定態(tài)。硫素的添加顯著降低了根際土壤中的非穩(wěn)定態(tài)，降低了根際As有效態(tài)。

有一些研究表明，硫素添加可以緩解重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[23-24]，這與我們的研究結(jié)果一致，硫素添加顯著增加了植物株高和水稻鮮重。但也有部分研究表明硫素的添加對(duì)水稻干重沒(méi)有顯著影響[9]，甚至在高濃度硫素添加條件下會(huì)降低水稻根長(zhǎng)[25]，這可能與土壤中的As含量有關(guān)。硫素添加緩解As對(duì)植物生長(zhǎng)的原因包括硫素添加可以促進(jìn)植物內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）的形成，通過(guò)形成As-植物螯合肽復(fù)合物將其固定在植物液泡中，增加植物對(duì)重金屬的耐性[26]。此外，硫素的添加降低了土壤中As的有效性及土壤溶液中的As（Ⅲ），從而緩解了As對(duì)植物毒性。

硫素的添加降低了水稻地上部（莖、葉）對(duì)As的累積，然而過(guò)量的硫素添加反而增加了米粒中的As，并且米粒中的As與土壤溶液中的As顯著負(fù)相關(guān)。有研究表明，隨土壤中As移動(dòng)性的增加，米粒中的As并不會(huì)增加，硫素的添加可能影響土壤溶液中As的移動(dòng)性，但是稻米中As的累積可能與根際硅的有效性有關(guān)[27]。這也表明，在不同土壤中施用硫素效果并不同，可能造成籽粒中As的增加，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全造成威脅。硫素的添加促進(jìn)了水稻根表膠膜的形成，增加了As在根際環(huán)境和水稻根表的固持[28]，這與我們的研究中水稻根表膠膜隨硫素的添加而增加是一致的，并且根表膠膜是As主要累積部位。硫素促進(jìn)根表膠膜形成的原因可能是硫在淹水稻田環(huán)境中被還原成S2-，而S2-可以還原Fe3+增加根際環(huán)境中的Fe2+，根際環(huán)境中Fe2+的含量是影響鐵膜形成的重要原因之一。本研究中，隨著硫素的添加，根際土壤溶液中Fe（Ⅱ）濃度降低也可能是因?yàn)榇罅縁e（Ⅱ）在根表氧化形成鐵膜。

4 結(jié)論

（1）對(duì)比滅菌處理和不滅菌處理，發(fā)現(xiàn)在添加As的污染土壤中微生物介導(dǎo)的還原溶出和非生物介導(dǎo)的還原溶出均存在，影響了土壤溶液As和Fe（Ⅱ）的移動(dòng)性。

（2）硫素的施用一定程度上降低了根際、非根際土壤溶液中的As和Fe（Ⅱ），降低了As的移動(dòng)性；土壤溶液中的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）也有一定程度的降低；硫素的添加顯著降低了根際土壤中As有效態(tài)；相同硫含量的硫酸鈉比單質(zhì)硫的影響更顯著。

（3）硫素的施用促進(jìn)了水稻生長(zhǎng)，增加了水稻產(chǎn)量，并且一定程度上降低了水稻地上部（莖、葉）對(duì)As的累積，但過(guò)量硫素的施用可能增加籽粒中的As含量。