周琪，張海萍，牛鳳玲，林婷，閆金銀

(河北省唐山市人民醫(yī)院，河北唐山063000)

乳腺癌發(fā)病人數(shù)大約占全球女性癌癥發(fā)病人數(shù)的23%，并成為女性癌癥死因之首，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]?；熓侨橄侔┤碇委熤胁豢苫蛉钡闹委熓侄?，給患者帶來了很大的生存獲益。研究[2～7]表明，大蒜的活性成分具有抗菌消炎、降血脂、預防心血管疾病、提高免疫力、抗氧化、神經(jīng)元保護、延緩衰老、防治腫瘤等多方面的功效[8～11]。S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)是大蒜素復雜混合物中的主要活性成分之一，因其化學性質(zhì)穩(wěn)定、生物利用度高而備受關注[12～14]。SAMC對多種惡性腫瘤(如大腸癌、膀胱癌、腎癌、骨腫瘤)體內(nèi)、體外的增殖均有抑制作用，但對乳腺癌細胞的作用相關研究相對較少。因此，本研究觀察了SAMC對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響，探討SAMC體外抗乳腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 MCF-7乳腺癌細胞購自百恩維生物科技有限公司，為低侵襲性乳腺癌細胞(ER、PR均為陽性，HER-2為陰性)。SAMC試劑購自北京世紀奧科生物技術有限公司。培養(yǎng)乳腺癌細胞的DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清等試劑均購自Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及SAMC用法 MCF-7細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，每2 d更換1次培養(yǎng)液，待對數(shù)生長期細胞大約長滿培養(yǎng)瓶底部面積的80%時，用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化、傳代，并以1×105/mL的量接種在50 mL的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實驗應用。將細胞分為4個組，分別加入濃度為0、25、50、100 μmol/L的SAMC。

1.3 細胞增殖能力檢測 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度濃度為1×104/mL接種于96孔板，按“1.2”方法加入不同濃度的SAMC，于給藥后24、48、72 h每孔加入20 μL的MTT溶液。培養(yǎng)結(jié)束后棄掉上清液，每孔分別加入100 μL的二甲基亞砜，震蕩10 min。用酶標儀在570 nm處測定各個孔的吸光度值(OD值)，以0 μmol/L SAMC組作為對照組，計算細胞增殖率：(1-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4 細胞凋亡率測算 選取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105/mL并接種于6孔板。按“1.2”方法分別加入不同濃度的SAMC，分別于給藥24、48、72 h后在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，離心，離心后的細胞懸液應用PBS洗滌3次，之后滴加碘化丙啶，避光環(huán)境下染色15 min，流式細胞儀檢測凋亡細胞，并計算細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖率比較 同一濃度組內(nèi)，給藥24、48、72 h后MCF-7細胞增殖率依次下降(P均<0.01)；相同培養(yǎng)時間下，0 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細胞增殖率依次下降(P均<0.01)。見表1。相關性分析結(jié)果顯示，給藥24、48、72 h后MCF-7細胞增殖率與SAMC濃度呈負相關(r分別為-0.17、-0.35、-0.71，P均<0.05)。

表1 不同給藥時間各組細胞增殖率比較

2.2 各組細胞凋亡率比較 同一濃度組內(nèi)，給藥后24、48、72 h后MCF-7細胞凋亡率依次增高(P均<0.01)；相同培養(yǎng)時間下，0 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細胞凋亡率依次增高(P均<0.01)。詳見表2。相關性分析結(jié)果顯示，MCF-7細胞凋亡率與SAMC濃度呈正相關(r=0.27，P<0.05)。

表2 不同給藥時間各組細胞凋亡率比較

3 討論

新鮮大蒜含有多種成分，但主要活性物質(zhì)為蒜氨酸、蒜酶及蒜氨酸-蒜酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生的含硫化合物。大蒜被加工或物理機械壓碎后，蒜氨酸會在蒜酶的催化下產(chǎn)生蒜素，蒜素極不穩(wěn)定，可進一步轉(zhuǎn)變?yōu)橐恍┯袡C硫化物混合物，這些硫化物(DAS、DADS、DATS、DATTS)具有很強的抗氧化作用，可通過清除體內(nèi)過多的氧自由基等物質(zhì)，起到維持細胞膜穩(wěn)定、保護細胞結(jié)構(gòu)完整的作用。在抗腫瘤方面，大蒜提取物可通過調(diào)節(jié)致癌物代謝、阻滯腫瘤細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、抗氧化和提高機體免疫力等途徑抑制動物體內(nèi)的腫瘤生長，同時，聯(lián)合應用還能提高化療藥物的治療效果[15～18]。

多項研究[19,20]證實大蒜提取物可有效的抑制乳腺癌細胞的生長。Li等[10]使用不同濃度的DATS干預乳腺癌細胞系MCF-7和SUM159，并采用Western blotting法檢測PCNA、Cyclin D1、Bcl-2及Bax蛋白，結(jié)果顯示，隨著DATS濃度的增加，PCNA、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達逐漸減小，Bax蛋白表達逐漸增加，間接證明，DATS可抑制乳腺癌細胞增殖，并促進其凋亡。

體外實驗中蒜素能夠比較穩(wěn)定地發(fā)揮其抗腫瘤作用，而在動物體內(nèi)實驗或在臨床試驗中，卻很難得到完美的大蒜素抗癌作用的證據(jù)[21～23]。深入研究發(fā)現(xiàn)其主要原因是蒜素的活性成分為有機硫化物混合物，這些硫化物化學性質(zhì)不穩(wěn)定，自然條件下容易分解。體外實驗時，藥物能迅速發(fā)揮抗癌作用，但當藥物進入體內(nèi)后可能很快被代謝、清除，從而很難發(fā)揮應有作用。

SAMC是蒜素的主要水溶性活性成分之一，無刺激性氣味，化學性質(zhì)穩(wěn)定。SAMC對很多惡性腫瘤如消化系統(tǒng)腫瘤、膀胱癌、甲狀腺癌等體內(nèi)、體外的增殖均可發(fā)揮抑制作用。在體內(nèi)實驗中，Kim等[24]發(fā)現(xiàn)SAMC可通過影響PKA信號轉(zhuǎn)導途徑預防膀胱癌的發(fā)生。有學者[25]使用人胃癌SGC-7901細胞皮下接種的方式建立裸鼠胃癌移植瘤模型，SAMC治療30 d后，脫頸處死小鼠，取瘤體行TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)SAMC治療組腫瘤的凋亡指數(shù)遠高于對照組，進一步研究顯示，SAMC可能是通過MAPK和PI3K/Akt信號通路對腫瘤生長產(chǎn)生影響。

本研究觀察了SAMC對乳腺癌MCF-7細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，同一濃度組內(nèi)，給藥后24、48、72 h后MCF-7細胞增殖率依次下降；相同培養(yǎng)時間下，0 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細胞增殖率依次下降；給藥24、48、72 h后MCF-7細胞增殖率與SAMC濃度呈負相關。而且，同一濃度組內(nèi)，給藥后24、48、72 h后MCF-7細胞凋亡率依次增高；相同培養(yǎng)時間下，0 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組細胞凋亡率依次增高；MCF-7細胞凋亡率與SAMC濃度呈正相關。上述研究結(jié)果表明MCF-7細胞的增殖速率隨著SAMC濃度的提高、干預時間的延長而下降，細胞凋亡率則隨著SAMC的濃度升高而增高，提示SAMC可以顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，并促進細胞凋亡，作用與濃度呈一定相關性。值得一提的是，由于本實驗為體外實驗，未對體內(nèi)研究進行驗證，故結(jié)果具有一定的局限性。鑒于SAMC的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在體內(nèi)模型中，接下來仍需進一步做動物體內(nèi)實驗進行抗乳腺癌作用的驗證。