王仰杰，周 鍵

（1. 安丘市興安畜牧獸醫(yī)管理站，山東安丘 262100；2. 安丘市畜牧局，山東安丘 262100）

肉雞大腸桿菌病是由禽病原性大腸埃希氏菌引起的一種急性或慢性細(xì)菌性傳染病[1]。該病菌血清型眾多，分布范圍較廣，表現(xiàn)形式復(fù)雜多變，具有較強(qiáng)的地域性，且易導(dǎo)致其他病原的并發(fā)感染或繼發(fā)感染，是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌性傳染病之一[2]。大腸桿菌在自然環(huán)境中分布很廣，在雞舍的墊料、飼料、糞便及灰塵中廣泛存在，是雞腸道內(nèi)常在菌和條件性致病菌，其發(fā)生常與雞舍環(huán)境惡劣、空氣質(zhì)量差、飼養(yǎng)密度高、免疫接種不到位、飼料或飲水污染等因素有關(guān)，引起的臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉，還可造成心包炎、肝周炎、臍炎、卵黃囊炎、輸卵管炎等。致病性大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，這也是導(dǎo)致目前使用抗生素防治大腸桿菌病效果越來(lái)越不理想的主要原因。致病性大腸桿菌具有區(qū)域流行性，其致病性在不同地區(qū)也存在較大差異，因此加強(qiáng)本地區(qū)肉雞大腸桿菌病的診斷與防治研究具有重要意義。為有效診斷和控制雞場(chǎng)大腸桿菌病疫情，了解當(dāng)?shù)厝怆u大腸桿菌的病原學(xué)特性及耐藥性，采用臨床診斷、細(xì)菌分離培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗(yàn)等方法，對(duì)安丘市某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞群進(jìn)行了雞大腸桿菌病的診斷和菌株耐藥分析，以期為當(dāng)?shù)卮竽c桿菌病的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來(lái)源 山東省安丘市發(fā)生疑似大腸桿菌病疫情的某飼養(yǎng)90 000只羅斯308品種的肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)。該場(chǎng)養(yǎng)殖模式為籠養(yǎng)，采用自動(dòng)加料、自助飲水、自動(dòng)出糞方式。

1.1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基：購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管：購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液：購(gòu)自濰坊康華生物技術(shù)有限公司；頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟、阿莫西林、氟苯尼考、恩諾沙星、新霉素、硫酸粘菌素、多西環(huán)素、替米考星：購(gòu)自天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查

到養(yǎng)殖場(chǎng)問(wèn)詢(xún)，并到雞舍實(shí)地觀察雞群臨床表現(xiàn)，對(duì)死亡雞只進(jìn)行剖檢觀察。

1.3 分離培養(yǎng)

將病死雞剖檢，無(wú)菌取肝臟在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線無(wú)菌接種，放置37 ℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取可疑單個(gè)菌落于普通瓊脂平板上進(jìn)行三區(qū)劃線純培養(yǎng)，放置37 ℃恒溫箱，培養(yǎng) 18～24 h 后，4 ℃保存?zhèn)溆肹3-4]。

1.4 染色鏡檢

挑取單個(gè)細(xì)菌涂片，經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[5]。

1.5 生化試驗(yàn)

將分離純化的細(xì)菌無(wú)菌接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（枸櫞酸鹽酸、靛基質(zhì)、M-R、V-P）中，然后放入恒溫箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果[6]。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用紙片法，對(duì)分離菌株進(jìn)行7種單一獸用抗菌藥物和8種聯(lián)合抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈大小并記錄結(jié)果[7]。

1.7 藥物治療試驗(yàn)

利用藥敏試驗(yàn)篩選出的敏感藥物，對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行藥物治療，每天記錄采食量和死淘率。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床及剖檢診斷

3 日齡雞群發(fā)病，采食量偏少，部分雞只出現(xiàn)閉眼、縮脖等癥狀，大群均勻度差，發(fā)病率為20%，死淘率為5%。剖檢10只病雞，均發(fā)現(xiàn)明顯的心包炎（圖1）、肝周炎（圖2）。根據(jù)臨床及解剖癥狀，判斷為疑似大腸桿菌感染。

圖1 病死雞心包炎癥狀

2.2 分離鑒定

分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 24 h后，可見(jiàn)邊緣整齊，稍凸起，表面光滑濕潤(rùn)，直徑為1.5～2 mm的粉紅色小菌落（圖3）。經(jīng)革蘭氏染色后，在油鏡下可見(jiàn)大量散在的、卵圓形或桿狀、中等大小的細(xì)菌。

2.3 生化試驗(yàn)

挑取疑似大腸桿菌菌落，經(jīng)純化培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定，發(fā)現(xiàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)和MR 試驗(yàn)均為陽(yáng)性，枸櫞酸鹽酸試驗(yàn)和VP 試驗(yàn)均為陰性，均符合大腸桿菌的生化特性（表1、圖4）。

2.4 藥敏試驗(yàn)

圖2 病死雞肝周炎癥狀

圖3 分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明（表2、圖5）：分離出的大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟，以及“頭孢噻呋鈉+硫酸粘菌素”“頭孢噻呋鈉+阿莫西林”“頭孢噻呋鈉+恩諾沙星”“頭孢噻呋鈉+新霉素”“替米考星+阿莫西林”“替米考星+頭孢噻呋鈉”達(dá)到了S級(jí)敏感。S級(jí)敏感比例從高到低依次為頭孢喹肟、“頭孢噻呋鈉+阿莫西林”“頭孢噻呋鈉+恩諾沙星”、頭孢噻呋鈉、“頭孢噻呋鈉+硫酸粘菌素”“頭孢噻呋鈉+替米考星”“頭孢噻呋鈉+新霉素”“阿莫西林+替米考星”。

表1 分離菌生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

圖4 生化試驗(yàn)前后試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

對(duì)新霉素、硫酸粘菌素、“多西環(huán)素+氟苯尼考”“替米考星+硫酸粘菌素”達(dá)到I級(jí)敏感，敏感比例從高到底依次為新霉素、“替米考星+硫酸粘菌素”、硫酸粘菌素、“多西環(huán)素+氟苯尼考”。

對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素達(dá)到R級(jí)敏感。

2.5 藥物治療試驗(yàn)

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用頭孢噻呋鈉對(duì)患病雞群進(jìn)行飲水治療，每天1次，用藥治療1 d后，死淘率明顯減少，采食量逐漸增加，連續(xù)使用4 d，死淘率降為0.2%。

3 討論

肉雞大腸桿菌病一年四季均可發(fā)生，冬季和夏季多發(fā)，飼養(yǎng)管理不當(dāng)，如養(yǎng)殖密度過(guò)大、舍內(nèi)氨氣濃度高、通風(fēng)不暢、衛(wèi)生條件差等均可促進(jìn)該病發(fā)生[8]。通過(guò)對(duì)該肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及詢(xún)問(wèn)了解，發(fā)現(xiàn)該場(chǎng)的飼養(yǎng)管理存在許多問(wèn)題，主要表現(xiàn)在養(yǎng)殖密度大、氨氣濃度高、養(yǎng)殖用具消毒不徹底等，這是導(dǎo)致大腸桿菌病發(fā)生的重要誘因。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該肉雞源大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟等β內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物表現(xiàn)敏感，因此該類(lèi)藥物應(yīng)作為肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)今后大腸桿菌病防治的首選藥物。該肉雞源大腸桿菌對(duì)新霉素、硫酸粘菌素等藥物表現(xiàn)中度敏感，對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等藥物高度耐藥，與李海華等[9]、Tikhonova等[10]的研究結(jié)果一致。這與該場(chǎng)不按流程用藥，隨意加大藥物劑量，頻繁換藥等不合理使用這些藥物相關(guān)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 藥物治療結(jié)果

為了驗(yàn)證聯(lián)合用藥效果，本研究進(jìn)行了兩種藥物聯(lián)合用藥體外藥敏試驗(yàn)，并同單一藥物使用效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌菌株對(duì)“頭孢噻呋鈉+阿莫西林”“頭孢噻呋鈉+恩諾沙星”的敏感性高于單一藥物。同時(shí)，將頭孢噻呋鈉同恩諾沙星、新霉素、硫酸粘菌素、替米考星組成聯(lián)合用藥，將阿莫西林同替米考星組成聯(lián)合用藥，均能達(dá)到敏感級(jí)別，且比“多西環(huán)素+氟苯尼考”“替米考星+硫酸粘菌素”等聯(lián)合用藥敏感性好，說(shuō)明針對(duì)肉雞大腸桿菌病，選擇β內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物作為必要的抗菌藥物，同其他藥物聯(lián)合用藥，可達(dá)到最好的防治效果。

本試驗(yàn)表明，藥敏試驗(yàn)對(duì)于大腸桿菌病等細(xì)菌病的防治具有積極作用。由于在不同地區(qū)、不同雞只、雞只不同生長(zhǎng)時(shí)期的藥敏結(jié)果不一樣，而大腸桿菌極易對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，因此應(yīng)盡可能通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物進(jìn)行防治。否則，耐藥性一旦產(chǎn)生，克隆株不斷向外界傳播，會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)或周邊地區(qū)耐藥性的蔓延擴(kuò)散[11]。因而，養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)將大腸桿菌納入監(jiān)測(cè)目標(biāo)，實(shí)時(shí)監(jiān)控其耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展過(guò)程，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果，制定科學(xué)、合理的防治方案。

4 結(jié)論

根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)觀察、臨床癥狀、剖檢病理變化及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，最后確診該病為雞大腸桿菌病。分離的大腸桿菌菌株對(duì)頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟等β內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物表現(xiàn)敏感，因此該類(lèi)藥物應(yīng)作為該肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌病防治的首選藥物。該菌對(duì)新霉素、硫酸粘菌素等中度敏感，對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等高度耐藥，說(shuō)明養(yǎng)殖場(chǎng)需要科學(xué)合理使用抗菌藥物，避免長(zhǎng)期使用單一藥物，可采取聯(lián)合用藥、輪換用藥、交叉用藥等多種方式。通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，對(duì)于雞大腸桿菌病的防治具有積極作用。