謝向萌，韋顯凱，梁 晟，覃小柳，梁仕增，閉璟珊，袁湖業(yè)，胡茂快

（1.橫縣動物疫病預(yù)防控制中心，廣西橫縣 530300；2. 廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；3. 橫縣陶圩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)站，廣西橫縣 530314）

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）感染禽類及其它易感動物引起的一種烈性、高度接觸性人獸共患傳染病。根據(jù)表面血凝素（HA）基因和神經(jīng)氨酸酶（NA）基因不同，AIV可分為16種H亞型和9種N亞型。其中，可感染人的亞型有H5N1、H5N6、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7、H10N8等[1-5]。AIV的傳播擴(kuò)散不僅對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害，也對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

2013 年2—3月間，我國上海?安徽等長三角區(qū)內(nèi)省份發(fā)生了嚴(yán)重的人急性下呼吸道感染，經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心鑒定，確定病原為H7N9流感病毒[6]。與其他亞型流感病毒一樣，H7N9亞型病毒一直在不斷進(jìn)化，并獲得了在哺乳動物體內(nèi)大量繁殖和毒力增強(qiáng)的能力，導(dǎo)致人感染和死亡[7]。2017 年以前，在家禽中分離的 H7N9 病毒絕大多為弱毒株，對家禽沒有致病力。2017 年后的監(jiān)測結(jié)果顯示，有些地區(qū)的H7N9 病毒已突變?yōu)楦咧虏⌒远局辏瑢﹄u有高致病力，而且流行范圍有擴(kuò)大趨勢，對養(yǎng)禽業(yè)帶來極大威脅[8-9]。

鑒于人間和禽間H7N9疫情防控形勢的變化，2017年6月農(nóng)業(yè)部要求廣東、廣西先行開展H7N9流感免疫試點(diǎn)工作，采用重組禽流感病毒二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re1株）進(jìn)行免疫注射。為評價該滅活疫苗在商品肉鵝中的安全性和有效性，進(jìn)行了田間免疫試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 重組禽流感病毒二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re1株）：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號為2017002。

1.1.2 試驗(yàn)動物 來自同一種鵝場、同一批次臨床健康商品代肉雛鵝（獅頭鵝），未經(jīng)H5禽流感病毒疫苗或“H5+H7”重組禽流感病毒疫苗免疫。1.1.3 主要試劑 禽流感病毒血凝抑制抗原H5N1 Re-8株和H7N9 Re-1株：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.2 安全性及效力試驗(yàn)

1.2.1 安全性試驗(yàn) 取2周齡雛鵝400只，平均分為2組，分別進(jìn)行單劑量和大劑量安全試驗(yàn)。每組分別采用肌肉和頸部皮下注射兩種方式，數(shù)量各100只。單劑量安全試驗(yàn)注射劑量為0.5 mL/只，大劑量為1.0 mL/只。另取2周齡雛鵝20只為對照，以相同劑量和方式注射生理鹽水。接種疫苗后，每日觀察各組的采食、飲水及精神狀況，判斷是否有不良臨床反應(yīng)。14 d后，疫苗接種組每組剖殺5只，對照組剖殺2只，觀察注射部位是否有炎癥反應(yīng)，以及疫苗吸收情況和臟器病理變化。免疫前及出欄前，每組隨機(jī)取20只鵝稱重，統(tǒng)計接種疫苗組和對照組的增重情況。

1.2.2 效力試驗(yàn) 取2周齡雛鵝500只，肌肉注射接種疫苗（0.5 mL/只），3周后以相同途徑加強(qiáng)免疫1次（1.5 mL/只）。免疫前和免疫后每周采血分離血清，分別檢測H7N9 Re-1和H5N1 Re-8株抗體，每次隨機(jī)取30只，直至出欄。對每次隨機(jī)選取的30只免疫鵝，全部采集喉/泄殖腔棉拭子，進(jìn)行H7N9病毒分離；若病毒分離陽性，則進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

1.3 抗體檢測

按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936-2003）中的血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）試驗(yàn)要求，進(jìn)行HI抗體效價測定。采用SPSS statistics 17.0，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。分析結(jié)果描述：P＜0.01表示差異極其顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示無顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 安全性試驗(yàn)

觀察發(fā)現(xiàn)，單劑量和大劑量肌肉注射、頸部皮下注射，以及對照組的采食、飲水及精神狀況均正常，未見不良臨床反應(yīng)。

接種后14 d，疫苗接種組每組剖殺5只鵝，對照組剖殺2只，進(jìn)行病理檢查。肌肉注射組：在注射部位均未觀察到炎癥、疫苗殘留現(xiàn)象，疫苗吸收良好（圖1-A、圖1-E）；氣囊清凈透明；心、肝、脾、胃、肺、腸管正常；淋巴結(jié)、胰腺正常；喉頭、咽喉、氣管正常（圖1-B、圖1-F）。皮下注射組：注射部位無炎癥，但發(fā)現(xiàn)大劑量接種組有2只出現(xiàn)少量疫苗殘留，疫苗吸收不完全（圖1-C、圖1-G）；氣囊清凈透明；心、肝、脾、胃、肺、腸管正常；淋巴結(jié)、胰腺正常；喉頭、咽喉、氣管正常（圖1-D、圖1-H）。對照組：注射部位及器官均正常（圖1-I、圖 1-J）。

圖1 疫苗接種組和對照組剖檢結(jié)果

分別在免疫前（2周齡）、免疫后（4周齡），每組隨機(jī)取20只鵝稱重。結(jié)果顯示，各組平均增重最大為2 225 g，最小為2 107 g（表1），無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 效力試驗(yàn)

免疫前后，隨機(jī)取30只鵝采樣檢測H7和H5抗體，共采樣檢測7次。結(jié)果顯示：免疫前，HI抗體滴度均為0；免疫后，H5、H7的HI抗體滴度逐漸上升（表2）。加強(qiáng)免疫后2周，H5、H7的HI抗體滴度平均值分別達(dá)到6.6 log2、6.4 log2，合格率達(dá)到了70%以上，符合國家要求（圖2）。免疫前后，共采集喉頭和泄殖腔棉拭子210個，由國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室對其進(jìn)行H7N9病毒分離。結(jié)果均為陰性。

表1 免疫前后鵝的平均體重 單位：g

圖2 抗體滴度和合格率變化曲線

3 分析與討論

3.1 疫苗免疫是必要的

2017年2月18日，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會向世界衛(wèi)生組織（WHO）報告，對從廣東省兩病例分離的H7N9病毒株進(jìn)行核酸序列分析，發(fā)現(xiàn)其在 HA1和 HA2之間的連接肽區(qū)有 4 個氨基酸插入[8]；2月21日，我國向世界動物衛(wèi)生組織（OIE）報告，從廣東省活禽市場中分離到這種病毒。研究顯示，該病毒已從對禽低致病性向高致病性轉(zhuǎn)化[10-11]。因此，對家禽接種 H7亞型疫苗，以高滴度抗體，阻止流感病毒在家禽體內(nèi)的復(fù)制以及傳播，進(jìn)而阻斷流感病毒由禽傳染給人，是預(yù)防該亞型流感病毒流行的最有效手段[12]。

表2 疫苗臨床應(yīng)用檢測結(jié)果

3.2 疫苗是安全的

無論是單劑量組，還是大劑量組，不管是肌肉接種，還是皮下接種，肉鵝采食、飲水及精神狀況均正常；剖檢未見淋巴、臟器有病理變化；喉頭和泄殖腔棉拭子樣品沒分離出H7N9病毒。這些均說明該重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗免疫接種肉鵝是安全的。從肉鵝免疫后增重情況分析，疫苗接種組平均增重2157～2225 g，對照組平均增重2 162 g，各組間無顯著差異，說明疫苗對鵝生長無影響。

3.3 疫苗是有效的

肉鵝免疫后3周，H5、H7抗體合格率分別達(dá)到93%、53%；免疫后5周（加強(qiáng)免疫后2周），HI抗體滴度都在5～8 log2之間，抗體整齊度好，而且H5、H7抗體合格率均為100%，說明該重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗免疫接種肉鵝是有效的。本試驗(yàn)為田間試驗(yàn)，沒有進(jìn)行免疫后的攻毒保護(hù)試驗(yàn)。但蔣文明等[13]進(jìn)行的H7N9亞型流感候選疫苗株攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，該疫苗株對H7N9具有很好的攻毒保護(hù)作用。

3.4 疫苗用法與用量。

從免疫效果可看出，肌肉或頸部皮下注射免疫接種肉鵝均切實(shí)可行。對2周齡雛鵝進(jìn)行首免，每只注射0.5 mL。5周齡時，以相同途徑加強(qiáng)免疫1次，每只1.5 mL，加強(qiáng)免疫后2周（即7周齡），肉鵝H5、H7抗體整齊度好，抗體合格率均達(dá)到100%。需要指出的是，只進(jìn)行1次免疫，免后3周時的H7抗體平均滴度僅為3.6 log2，抗體合格率為53%，達(dá)不到平均滴度4 log2以上、合格率70%以上的保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，因此肉鵝開展兩次免疫是非常必要的。由于疫苗為油苗，沒有進(jìn)行滴鼻免疫實(shí)驗(yàn)?？紤]到肌肉注射的普遍性，本試驗(yàn)并沒有進(jìn)行皮下注射試驗(yàn)。

4 結(jié)論

本研究使用重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗免疫商品肉鵝，通過單劑量和大劑量安全試驗(yàn)，未見肉鵝有不良臨床反應(yīng)及疫苗副反應(yīng)，對生長無影響，說明疫苗安全性較好；效力試驗(yàn)表明，加強(qiáng)免疫后，H5、H7抗體合格率均可達(dá)到100%，疫苗保護(hù)效果較好。建議在2周齡時，對雛鵝進(jìn)行首免，每只注射0.5 mL，5周齡時加強(qiáng)免疫1次，每只1.5 mL，這樣可取得理想的免疫保護(hù)效果。