林瑪麗 蔡旭龍 李秀洪 曹珊 劉運廣 李東秀 陳霞靜 李東明 林娜

【摘要】 目的 探討IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A兩位點的多態(tài)性在廣西黑衣壯兒童中的分布特點及其與不同種族人群的比較。方法 采用多重連接酶檢測反應(yīng)（improved multi-ligase detection reaction，imLDR）技術(shù)對251例受試者（黑衣壯兒童121人，漢族兒童130人）的IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位點多態(tài)性進行基因分型。用統(tǒng)計學方法分析其分布頻率及組間差異。結(jié)果 rs4740840G/A存在AA、AG、GG三種基因型，分布頻率分別為21.5%、46.3%、32.2%。其各基因型及等位基因頻率在廣西黑衣壯兒童、漢族兒童中分布差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。廣西黑衣壯兒童基因型和等位基因頻率與人類基因組計劃公布的歐洲人相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），與北京漢族人、日本人、非洲黑人相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。rs16924159G/A存在AA、AG、GG三種基因型，分布頻率分別為5.8%、34.7%、59.5%。其各基因型及等位基因頻率在廣西黑衣壯兒童、漢族兒童之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。廣西黑衣壯兒童基因型及等位基因分布頻率與人類基因組計劃公布的北京漢族、非洲黑人相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與日本人、歐洲人相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A在廣西黑衣壯兒童分布存在多態(tài)性，同時還存在著不同程度的種族和地區(qū)差異。

【關(guān)鍵詞】 IL-33；基因多態(tài)性；廣西；黑衣壯；兒童；種族

中圖分類號：R394.5 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.001

【Abstract】 Objective To explore the distribution characteristics of rs4740840G/A and rs16924159G/A polymorphisms of interleukin-33（IL-33） gene in Black-clothes Zhuang children in Guangxi and its comparison with different ethnic groups.Methods The polymorphisms of rs4740840G/A and rs16924159G/A of IL-33 gene in 251subjects（121Black-clothes Zhuang children and 130 Han children） was genotyped by improved multi-ligase detection reaction （im-LDR） technique.And distribution frequencies and differences were analyzed by statistical methods between groups.Results Three genotypes （AA，AG and GG） were found in rs4740840G/A with frequency of 21.5%，46.3% and 32.2%，respectively.The genotype and allele frequencies of rs4740840G/A showed statistically significant difference between Black-clothes Zhuang children and Han children in Guangxi（P<0.05）.The frequency of genotypes and alleles in the Black-clothes Zhuang children in Guangxi was statistically different from that of the Europeans published by Human Genome Project（P<0.01），but it was not statistically different from those of Beijing Han，Japanese and African（P>0.05）.Three genotypes（AA，AG and GG） were found in rs16924159G/A with frequency of 5.8%，34.7% and 59.5%，respectively.The genotype and allele frequencies of 16924159G/A showed statistically significant difference between Black-clothes Zhuang children and Han children in Guangxi（P<0.01）.The distribution frequency of genotypes and alleles in Black-clothes Zhuang children in Guangxi was statistically significant compared with those in Beijing Han and African published by the Human Genome Project（P<0.05），but there was no statistically significant difference between the Japanese and the Europeans（P>0.05）.Conclusion The distribution of rs4740840G/A and rs16924159G/A of IL-33 gene shows polymorphisms in Black-clothes Zhuang children in Guangxi，which exists varying degrees of racial and regional differences

【Key words】 IL-33；gene polymorphism；Guangxi；Black-clothes Zhuang；ethnic group

白細胞介素33（Interleukin-33，IL-33）是ST2的配體，屬于IL-1家族中的新成員，于2005年被Schmitz等[1]發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)已證實，IL-33/ST2信號通路與感染、哮喘、系統(tǒng)性硬化病、心肌梗死等疾病的發(fā)病機制相關(guān)聯(lián)[2～5]。由于基因多態(tài)性在種族、民族和地域間存在差異，在不同的種族、民族和地域之間，很多疾病的發(fā)病率明顯不同，雖然環(huán)境、生活習慣等因素在疾病的發(fā)生過程中起著一定的作用，但不同民族在遺傳背景上的差異是導致疾病易感性不同的一個重要因素[6]。近年來，IL-33的基因多態(tài)性對疾病的影響逐漸被重視，如在強直性脊柱炎、冠心病、哮喘、阿爾茨海默病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、精神分裂癥等均與IL-33單核苷酸多態(tài)性有關(guān)[7～12]。我們通過查找人類基因掃描圖譜所公布的IL-33基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位點突變率高，研究這兩個位點在廣西黑衣壯人群中的分布頻率同其他民族人群是否存在著差異，為今后研究IL-33的基因多態(tài)性與不同種族、地域間的疾病易感性的影響打下基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象共251名兒童，男142人，女109人，年齡3～15歲，其中黑衣壯121人，漢族130人。民族篩選界定條件為：三代直系親屬中均為本民族的健康體檢兒童。樣本均取自右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢中心。所有研究對象均為廣西地區(qū)，相互間無血緣關(guān)系。在年齡及性別組成上，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。以上研究對象患兒家屬和（或）其監(jiān)護人均對本研究知情，并自愿簽署知情同意書。此研究已通過本單位的倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取靜脈血2 ml，加入EDTAN2抗凝。用（天根M16核酸自動抽提儀）提取DNA，DNA樣本取1 μL 1% agarose電泳對其樣本進行質(zhì)量檢查以及濃度估計，然后根據(jù)估計的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10 ng/μL，-80℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計 通過primer3在線軟件（http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。擴增rs4740840G/A位點和rs16924159G/A位點的引物序列（見表1）。

1.2.3 檢測目的基因分型 采用imLDR多重SNP分型技術(shù)對IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位點進行基因分型。PCR反應(yīng)：PCR擴增反應(yīng)體系（10 μL）包含1x GC-I buffer1.5 μL，Mg2+ 1.5 μL，dNTP 0.3 μL，Taq 酶1 μL，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物，雙蒸水補至10 μL。充分混勻，放入PCR擴增儀擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃×2 min；94℃×20 s，65℃×40 s，72℃×1.5 min，共11個循環(huán)；94℃×20 s，59℃×30 s，72℃×1.5 min共24個循環(huán)；72℃×2 min，4℃ forever。PCR產(chǎn)物純化：在10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U蝦堿酶（SAP，Promega公司）和2 U核酸外切酶Ⅰ（Epicentre公司），37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。連接反應(yīng)：反應(yīng)體系10x連接緩沖液1 μL、高溫連接酶 0.25 μL、5連接引物混合液（1 μM）0.4 μL，3連接引物混合液（2 μM）0.4 μL、純化后多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 6 μL混勻。連接條件：94℃ 1 min→56℃ 4 min擴增38個循環(huán)，4℃ forever。取0.5 μL稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di混勻，95℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀測序，并用Gene Mapper 4.1分析其基因多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)。各位點基因型及等位基因頻率采用直接計數(shù)法，兩組間基因型及等位基因頻率分布差異采用χ2檢驗，檢驗水準：α=0.05。遺傳平衡分析用Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結(jié)果

2.1 IL-33基因位點rs4740840G/A、rs16924159G/A的基因分型 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗分析，兩位點基因型均達Hardy-Weinberg平衡，所選人群群體代表性好（均P>0.05），結(jié)果具有群體代表性。rs4740840G/A存在三種基因型，分別為AA、AG、GG，基因型峰型見圖1。rs16924159G/A存在三種基因型，分別為AA、AG、GG，基因型峰型見圖2。

2.2 兩位點在廣西黑衣壯兒童、漢族兒童之間的分布及與各種族人群間比較 IL-33基因rs4740840G/A存在3個基因型：AA、AG、GG，其基因型及等位基因的分布頻率在廣西地區(qū)黑衣壯兒童、漢族兒童之間的分布差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。廣西黑衣壯兒童各基因型及等位基因的分布頻率與歐洲人相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），與北京漢族人、日本人、非洲黑人相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。廣西漢族兒童與北京漢族人群在基因型頻率分布上差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。rs16924159G/A存在3個基因型：AA、AG、GG。廣西黑衣壯兒童基因型及等位基因的分布頻率與廣西漢族兒童、北京漢族、非洲黑人相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與日本人及歐洲人相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。廣西漢族兒童與北京漢族人群在基因型及等位基因頻率分布上均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

近年來，隨著分子生物學及基因組學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)IL-33基因序列中存在多個SNP位點，而這些多態(tài)性位點可能與某些疾病的發(fā)病機制存在一定關(guān)系。遺傳和地域差異可以導致某些疾病易感性不同，通過對不同地域人群基因多態(tài)性的研究，一方面，有助于進一步了解某一疾病的易感性在不同種族人群間的表達，對某些疾病的基因診斷及治療有更深遠的意義，為將來在不同種族人群中進行個體化治療提供更完善的方案；另一方面，有助于進一步豐富我國少數(shù)民族基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)庫。通過對正常人群基因多態(tài)性的研究，為今后研究疾病與基因多態(tài)性的關(guān)系提供了更有利的條件。

人類IL-33基因定位于9號染色體（9p24.1）上，編碼270個氨基酸多肽，其相對分子質(zhì)量為30 kDa[9]。IL-33作為IL-1家族的第11位細胞因子，其結(jié)構(gòu)與IL-1α、IL-18β-三葉結(jié)構(gòu)域相似，主要在上皮細胞及內(nèi)皮細胞中表達，如呼吸道、消化道、皮膚等黏膜組織，在脾臟、胰腺、腎臟、心臟等組織中也有少量表達[13]。IL-33是一種多功能因子，它既可以作為一種核因子調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，又可以作為細胞因子參與調(diào)節(jié)Th2型的免疫反應(yīng)[14～15]。關(guān)于IL-33基因SNP的研究，Queiroz GA等[16]在巴西人口的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-33和IL1RL1單核苷酸多態(tài)性與過敏和哮喘的遺傳變異標記具有一定關(guān)聯(lián)性。Yue J等[14]發(fā)現(xiàn)IL-33 rs16924159可能與中國漢族人群復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機制有關(guān)。Angeles-Martínez J等[17]發(fā)現(xiàn)IL-33 rs7044343 T等位基因與降低墨西哥患者早發(fā)冠心病和中心性肥胖的風險有關(guān)，并可能參與調(diào)節(jié)細胞的生產(chǎn)，而rs16924159與冠心病及中心性肥胖的發(fā)生無明顯相關(guān)性。這可能與IL-33基因存在多個功能性SNP位點有關(guān)，從而影響某些疾病的發(fā)生、發(fā)展[18]。

壯族是中國人口最多的一個少數(shù)民族，主要分布在廣西，地處中國西南邊界，其地貌獨特，人群及生活環(huán)境相對穩(wěn)定，而黑衣壯是壯族的一個支系，主要聚居在廣西那坡縣境內(nèi)[19～ 20]。本文檢測了廣西黑衣壯、漢族兩族健康兒童人群IL-33 rs4740840G/A、rs16924159G/A多態(tài)性位點分布，分析比較該多態(tài)性位點與不同種族、地域間的分布差異，研究對象年齡及性別組成上無明顯差異。我們的研究發(fā)現(xiàn)，IL-33 rs4740840G/A、rs16924159G/A兩位點在廣西黑衣壯兒童、漢族兒童之間均存在明顯差異，說明這兩個位點在同一地域及生活環(huán)境下同樣也存在著較強的種族性差異，rs4740840G/A在廣西黑衣壯兒童與北京漢族人群之間并無顯著差異，而rs16924159G/A在廣西黑衣壯兒童與北京漢族人群之間卻存在顯著差異，這又體現(xiàn)了同一基因的不同位點在中國南北人群間的差異，這可能與廣西特殊的地理位置及黑衣壯獨有的民族特色有關(guān)，因此遺傳背景相對單純。rs4740840G/A在廣西漢族兒童與北京漢族人群之間存在差異，這又說明同一種族，環(huán)境地域不同可能對基因突變有影響。因地域跨度較大，可能存在一定的遺傳素質(zhì)差異。此外，我國人口眾多，且為多民族、多元化國家，遺傳背景復雜。而廣西黑衣壯兒童與歐洲人及非洲黑人為不同膚色不同種族人群，親緣關(guān)系較遠，多態(tài)性分布差異大，本次研究驗證了多態(tài)性位點rs4740840G/A、rs16924159G/A分別在歐洲人及非洲黑人上體現(xiàn)出了這一明顯差異，無論是基因型還是等位基因頻率。同一基因不同多態(tài)性位點與同一種族的關(guān)系研究結(jié)果不同，除了與地域差異有關(guān)，還可能是由于某一基因片段在不同種族人群間的表達不同造成的。而多態(tài)性的分布差異除了與種族、地域相關(guān)外，不同的生活環(huán)境、飲食、生活方式、氣候等因素亦會影響基因多態(tài)性的分布差異。本研究主要針對廣西地區(qū)的黑衣壯兒童進行遺傳多態(tài)性與不同地區(qū)民族及不同種族進行比較，因為不同地域人群遺傳性存在差異，可能造成了研究結(jié)果的不一致。

SNP作為人群、地域的一種標志，是可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的 90%以上，與種族差異、疾病易感性及藥物反應(yīng)差異有關(guān)。近年來，隨著基因測序等技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)不同的遺傳背景表現(xiàn)出對疾病的易感性和預后質(zhì)量呈現(xiàn)出不同差異，因此正確分析各基因多態(tài)性的分布特點，一方面，為研究IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A位點多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)病機制以及疾病的防治提供科學有效的途徑，另一方面，也為人類學和群體遺傳學的研究提供基礎(chǔ)理論知識。同時，我們的研究也存在不足，一是由于本實驗樣本量較少，并受到實驗和環(huán)境等因素影響，這種分布差異仍需大量實驗證實，其次是未與更多人群進行分析比較，結(jié)果僅具有區(qū)域代表性，如何深入研究 IL-33基因多態(tài)性在不同民族、種族人群中對疾病的影響，是今后我們努力研究的方向。

參 考 文 獻

[1] Schmitz J，Owyang A，Oldham E，et al.IL-33，an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines[J].Immunity，2005，23（5）：479-490.

[2] Rostan O，Arshad MI，Piquet-Pellorce C，et al.Crucial and diverse role of the interleukin-33/ST2 axis in infectious diseases[J].Infect Immun，2015，83（5）：1738-1748.

[3] 蔡旭龍，林 娜.白介素-9基因多態(tài)性及其血清水平與黑衣壯兒童哮喘發(fā)病的關(guān)系[J].廣西醫(yī)學，2017，39（1）：15-17.

[4] Koca SS，Pehlivan Y，Kara M，et al.The IL-33 gene is related to increased susceptibility to systemic sclerosis[J].Rheumatol Int，2016，36（4）：579-584.

[5] Yang JH，Wu FQ，Wen Q，et al.Association of IL33/ST2 signal pathway gene polymorphisms with myocardial infarction in a Chinese Han population[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2015，35（1）：16-20.

[6] Guo J，Xiang Y，Peng YF，et al.The association of novel IL-33 polymorphisms with sIL-33 and risk of systemic lupus erythematosus[J].Mol Immunol，2016，77：1-7.

[7] Fan D，Ding N，Yang T，et al.Single nucleotide polymorphisms of the interleukin-33 （IL-33） gene are associated with ankylosing spondylitis in Chinese individuals： a case-control pilot study[J].Scand J Rheumatol，2014，43（5）：374-379.

[8] Tu X，Nie S，Liao Y，et al.The IL-33-ST2L pathway is associated with coronary artery disease in a Chinese Han population[J].Am J Hum Genet，2013，93（4）：652-660.

[9] Charrad R，Kaabachi W，Berraies A，et al.IL-33 gene variants and protein expression in pediatric Tunisian asthmatic patients[J].Cytokine，2018，104：85-91.

[10] Zhong X，Liu MY，He M，et al.Association of interleukin-33 gene polymorphisms with susceptibility to late onset Alzheimer's disease：a meta-analysis[J].Neuropsychiatr Dis Treat，2017，13：2275-2284.

[11] Xu W，Liu Y，Ye D.Association between IL-33 Gene Polymorphisms （rs1929992，rs7044343） and Systemic Lupus Erythematosus in a Chinese Han Population[J].Immunol Invest，2016，45（7）：575-583.

[12] Kordi-Tamandani DM，Bahrami AR，Sabbaghi-Ghale-No R，et al.Analysis of IL-33 gene polymorphism （rs11792633 C/T） and risk of schizophrenia[J].Mol Biol Res Commun，2016，5（1）：45-48.

[13] Sun XL，Law BY，de Seabra RDI，et al.Pathogenesis of thromboangiitis obliterans：Gene polymorphism and immunoregulation of human vascular endothelial cells[J].Atherosclerosis，2017，265：258-265.

[14] Yue J，Tong Y，Xie L，et al.Genetic variant in IL-33 is associated with idiopathic recurrent miscarriage in Chinese Han population[J].Sci Rep，2016，6：23806.

[15] Ren X，Guo M，Liu C，et al.A Case-Control Study Indicates that no Association Exists Between Polymorphisms of IL-33 and IL-1RL1 and Preeclampsia[J].Cell Physiol Biochem，2016，38（4）：1406-1414.

[16] Queiroz GA，Costa RS，Alcantara-Neves NM，et al.IL33 and IL1RL1 variants are associated with asthma and atopy in a Brazilian population[J].Int J Immunogenet，2017，44（2）：51-61.

[17] Angeles-Martínez J，Posadas-Sanchez R，Llorente L，et al.The rs7044343 Polymorphism of the Interleukin 33 Gene Is Associated with Decreased Risk of Developing Premature Coronary Artery Disease and Central Obesity，and Could Be Involved in Regulating the Production of IL-33[J].PLoS One，2017，12（1）：e168828.

[18] 郭 靜，向 陽，黃華佗，等.廣西人群中白介素-33基因rsl891385A/C、rs10975519C/T多態(tài)性的分布特點[J].南方醫(yī)科大學學報，2016，36（7）：964-968.

[19] 郭 靜，向 陽，彭友帆，等.廣西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G多態(tài)性的分布特點[J].中國免疫學雜志，2016，32（6）：849-852.

[20] 吳曉靜，鐘丹妮，葉德志，等.廣西黑衣壯族高膽紅素血癥新生兒UGT1A1 基因突變分析[J].中國當代兒科雜志，2014，16（5）：483-488.