楊 濤, 汪小鵬, 徐李鋼, 歐陽(yáng)斐, 許 濤

(湖北省武漢市第四醫(yī)院(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院) 重癥醫(yī)學(xué)科, 湖北 武漢, 430034)

中藥甘松是敗醬科甘松屬植物，具有理氣止痛、開郁醒脾的功效[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[2-4]發(fā)現(xiàn)甘松具有對(duì)大鼠抗心律失常的作用。研究[5]還發(fā)現(xiàn)甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不明確。甘松揮發(fā)油是甘松的有效濃縮成分[6-7], 本研究觀察甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷及PI3K通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

甘松揮發(fā)油購(gòu)自江西吉平天然植物油有限公司(生產(chǎn)批號(hào): 160808), 按2005年版《中國(guó)藥典》Ⅰ部附錄方法提取, 20 ℃下密度為0.949 kg/L, 甘松醇含量為98.4%。甘松揮發(fā)油與二甲基亞砜(DMSO, 購(gòu)于武漢谷歌生物科技有限公司)按1∶3比例配置后再用生理鹽水稀釋。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

心電及有創(chuàng)血壓監(jiān)護(hù)儀PHILIP G 80(上海光電儀器有限公司生產(chǎn)); 動(dòng)物人工呼吸機(jī) ALC V8S型(上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)); 心肌肌鈣蛋白(cTnT)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)采用ELISA法檢測(cè)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、糖原合成酶激酶(GSK 3β)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)采用Western Blot法檢測(cè)(武漢谷歌生物科技有限公司提供試劑盒)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康清潔級(jí)SD大鼠80只(武漢谷歌生物科技有限公司提供, 170010170), 周齡(12.00±1.00)周，體質(zhì)量(250.00±20.00) g, 雌雄不限。將上述大鼠隨機(jī)分成5組: ① 假手術(shù)組(n=10); ② 缺血再灌注組(IR組)(n=20); ③ 高劑量甘松揮發(fā)油(HD)組(n=20), 取0.1 μg/mL甘松揮發(fā)油1 mL, 于再灌注前經(jīng)股靜脈緩慢推注; ④ 低劑量甘松揮發(fā)油(LD)組(n=20), 取0.001 μg/mL甘松揮發(fā)油1 mL, 于再灌注前經(jīng)股靜脈緩慢推注; ⑤ 二甲基亞砜(DMSO)組(n=20), 取0.3‰ DMSO 1 mL, 于再灌注前經(jīng)股靜脈緩慢推注。

1.4 動(dòng)物缺血再灌注模型建立

采用20%烏拉坦，按1.0～1.5 g/kg劑量對(duì)大鼠行腹腔注射，待大鼠麻醉后固定于操作臺(tái)，取仰臥位。記錄心電圖，使用動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣。行右側(cè)頸動(dòng)脈置管監(jiān)測(cè)有創(chuàng)動(dòng)脈血壓。距胸骨左緣剪斷第3、4肋骨并打開胸腔，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間找到左冠狀靜脈并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，當(dāng)心電圖出現(xiàn)ST段抬高、QRS波高大增寬時(shí)，視為左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功。在左冠狀動(dòng)脈阻斷30 min后，再灌注60 min, 其中假手術(shù)組不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。

1.5 指標(biāo)檢驗(yàn)

大鼠血壓、心電信息采集: 大鼠麻醉后，在建立心肌缺血再灌注模型前，先行股動(dòng)脈和靜脈穿刺置管，連接有創(chuàng)動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)儀，排空連接管中空氣，并進(jìn)行大氣校零。

標(biāo)本采集: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采集大鼠動(dòng)脈血，在室溫中放置30 min后以4 000轉(zhuǎn)/min離心10 min, 取上層血清檢測(cè)CK-MB、cTnT; 采血后靜脈注射5%伊文思藍(lán)1.5 mL, 待大鼠口唇藍(lán)染，取出心臟并剔除心房和右室組織。將標(biāo)本置入-20 ℃冰箱20 min后取出，自心尖向心底平行房室溝方向切出相等厚度的5片心肌片，計(jì)算其上、下兩面的面積。再將切片置于1%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中, 37 ℃溫孵30 min。觀察到的藍(lán)色區(qū)域?yàn)榉侨毖獏^(qū)，白色區(qū)域?yàn)槿毖Ｋ绤^(qū)，紅色區(qū)域?yàn)槿毖垂Ｋ绤^(qū)。左心室面積(LV)為非缺血區(qū)、缺血梗死區(qū)和缺血未梗死區(qū)之和; 缺血區(qū)面積(AAR)為缺血未梗死區(qū)和缺血梗死區(qū)之和; 梗死區(qū)面積(IS)為缺血梗死區(qū)面積。分別計(jì)算缺血區(qū)面積百分比=AAR/LV×100%; 梗死區(qū)面積百分比= IS/AAR×100%。假手術(shù)組不作心梗面積測(cè)定; IR組、LD組、HD組、DMSO組各取10只大鼠，按上述實(shí)驗(yàn)方式行心肌梗死面積測(cè)定。

Western blot: 再灌注結(jié)束后，假手術(shù)組、IR組、HD組、LD組各10只大鼠，在左側(cè)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線以下5 mm處取左心室全層心肌組織1.0 g, 切成非常細(xì)小的碎片制成勻漿，經(jīng)離心后取上清液，用BCA法測(cè)蛋白濃度，經(jīng)灌膠與上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉1 h, 稀釋一抗，二抗室溫下孵育30 min, 用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。以β-acting條帶為內(nèi)參照，凝膠圖像分析測(cè)定Akt/磷酸化Akt (p-Akt)、GSK-3β/磷酸化GSK-3β (p-GSK-3β)、eNOS/磷酸化eNOS (p-eNOS)條帶與β-acting條帶灰度值，取其比值為相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)的變化比較

與假手術(shù)組比較, IR組、HD組、LD組及DMSO組MAP水平均顯著降低(P<0.05), 而IR組、HD組、LD組及DMSO組MAP水平比較無(wú)顯著差異(P>0.05); 與假手術(shù)組比較，IR組、HD組、LD組及DMSO組HR水平均顯著降低(P<0.05), 但I(xiàn)R組、HD組、LD組及DMSO組HR水平比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組MAP和HR的變化比較

與假手術(shù)組比較, *P<0.05。

2.2 各組血清心肌損傷標(biāo)記物的表達(dá)

與假手術(shù)組比較, IR組、HD組、LD組及DMSO組血清心肌標(biāo)記物CK-MB和cTnT水平均較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05); HD組血清心肌標(biāo)記物CK-MB和cTnT水平較IR組和LD組及DMSO組均顯著下降(P<0.05), LD組和DMSO組血清心肌標(biāo)記物CK-MB和 cTnT水平與IR組比較均無(wú)顯著變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清心肌損傷標(biāo)記物的表達(dá)

與假手術(shù)組比較, *P<0.05; 與IR組比較, #P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌梗死面積百分比比較

IR組、HD組、LD組及DMSO組AAR/LV比較無(wú)顯著差異(P>0.05); HD組IS/AAR較IR組顯著減少(P<0.05); LD組、DMSO組與IR組IS/AAR比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌梗死面積 %

與IR組比較, *P<0.05。AAR/LV為缺血區(qū)面積百分比,IS/AAR為梗死區(qū)面積百分比。

2.4 各組AKT通路蛋白及磷酸化后的表達(dá)

各組AKT、GSK-3β、eNOS蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05); HD組p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS蛋白表達(dá)較IR組顯著升高(P<0.05); LD組p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS蛋白表達(dá)較IR組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表4、圖1。

表4 各組AKT通路蛋白及磷酸化后的表達(dá)

與IR組比較, *P<0.05; 與HD組比較, #P<0.05。

圖1 各組AKT通路蛋白及磷酸化后的表達(dá)

3 討 論

缺血后處理是通過(guò)反復(fù)短暫的缺血再灌注處理后，再灌注缺血心肌細(xì)胞能誘導(dǎo)心肌保護(hù)作用[8]。藥物后處理是指心肌再灌注前通過(guò)藥物誘發(fā)內(nèi)源性保護(hù)作用，從而對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[9-10]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)是位于心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的電壓和鈣離子依賴性通道，正常情況下mPTP處于閉合狀態(tài)，限制離子和代謝物質(zhì)自由通過(guò)，從而保持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，在心肌缺血再灌注時(shí)mPTP異常開放，最終線粒體破壞，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[11-13]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)為再灌注損傷挽救激酶(RISK)信號(hào)通路中的一種。PI3K將細(xì)胞外信號(hào)傳遞給AKT并激活, p-AKT進(jìn)一步促進(jìn)GSK-3β、eNOS。其中GSK-3β參與心肌細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程，同時(shí)磷酸化后的GSK-3β能夠抑制mPTP開放，從而減少心肌損傷[14-17]。研究[18-19]還顯示線粒體ATP敏感性鉀通道也是后處理的重要信號(hào)通路，線粒體ATP敏感性鉀通道開放可抑制mPTP開放，從而減少心肌損傷。現(xiàn)已明確甘松揮發(fā)油能可逆性地抑制心肌細(xì)胞膜表面鈉離子通道、鉀離子通道以及鈣離子通道，其作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性[20-22], 但其是否能作用于線粒體通道尚不確定。

本研究檢測(cè)了假手術(shù)組、IR組、HD組及LD組的AKT/p-AKT、GSK-3β/p-GSK-3β、eNOS/p-eNOS蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組、IR組、HD組、LD組AKT、GSK-3β、eNOS表達(dá)均無(wú)明顯差異，但高劑量甘松揮發(fā)油組p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS表達(dá)明顯高于IR組，而低劑量甘松揮發(fā)油組p-AKT、p-GSK-3β、p-eNOS的表達(dá)較IR組無(wú)顯著變化。證明甘松揮發(fā)油可能通過(guò)激活PI3K信號(hào)通路，并激活其下游AKT、GSK-3β、eNOS蛋白表達(dá)而保護(hù)缺血再灌注心臟，并與其劑量大小有關(guān); 激活后的GSK-3β抑制mPTP開放，從而減少心肌損傷，起到保護(hù)作用。

本研究表明，心肌缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致MAP、HR呈下降趨勢(shì)，甘松揮發(fā)油組對(duì)大鼠MAP、HR無(wú)明顯影響; 高劑量甘松揮發(fā)油組大鼠心肌梗死面積減少，但心肌缺血面積沒有變化，同時(shí)心肌損傷標(biāo)記物CK-MB、cTnT在甘松揮發(fā)油組也明顯降低，而低劑量甘松揮發(fā)油組對(duì)大鼠心肌損傷標(biāo)記物水平、心肌梗死面積則較IR組無(wú)變化。DMSO組結(jié)果表明，甘松揮發(fā)油溶劑DMSO對(duì)心肌缺血再灌注損傷作用無(wú)影響。根據(jù)CKMB、心肌梗死面積提示較高劑量的甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[23]。

綜上所述，一定劑量的甘松揮發(fā)油可能通過(guò)激活PI3K通路，并進(jìn)一步激活下游GSK-3β等蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步抑制mPTP開放從而保護(hù)心肌缺血再灌注損傷，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。