武 棟

（山西省魚病防治中心 山西太原 030002）

微衛(wèi)星標記，又被稱為短串聯(lián)重復序列或簡單重復序列，是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，由2～6個核苷酸的串聯(lián)重復片段構(gòu)成，由于重復單位的重復次數(shù)在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標記的應用非常廣泛。微衛(wèi)星位點通常通過PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過電泳分析并根據(jù)大小分離等位基因進行檢測。根據(jù)微衛(wèi)星的重復類型可以把微衛(wèi)星分為完全、不完全和復合型微衛(wèi)星。微衛(wèi)星在基因組中數(shù)目巨大，據(jù)估計，真核基因組中平均每6kb就存在一個微衛(wèi)星序列[1]。毛細管電泳法是一項高效快速的分離分析技術(shù)，該方法以PCR擴增含有微衛(wèi)星位點的目的DNA片段為基礎(chǔ)，然后利用毛細管電泳法分離分析。毛細管電泳法主要是快速、微量、分辨率高、重復性好、易于定量和適合自動化檢測等優(yōu)點，它能保證系統(tǒng)的穩(wěn)定性和PCR擴增的效果。因此，微衛(wèi)星標記是強大的家庭跟蹤工具[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料來自長江水系四大家魚原種場人工繁殖的草魚群體，包含該群體的所有親本（父本14尾及母本16尾）及隨機抽取的子代66尾，共96尾。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集及基因組DNA的提取

草魚30尾親本和隨機子代樣本66尾，剪取尾鰭，用95%乙醇浸泡，置4℃保存。本實驗所用的軟體動物基因組DNA提取試劑盒和提取草魚鰭條DNA的方法均由天根生化科技有限公司提供。鰭條DNA提取后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取物的完整性和純度，并存儲在-20℃冰箱備用。

1.2.2 引物來源

本試驗10個微衛(wèi)星引物參照現(xiàn)已發(fā)表的文獻[3]，由廣州省艾基生物工程技術(shù)公司合成。

1.2.3 PCR擴增及檢測

反應體系共 20 μL：1.2 μL 的基因組 DNA，0.2 μL的 10×buffer，0.8 μL 25 mmol/L 的 Mg2＋，0.2 μL 5U/μL的 Taq 酶，稀釋后的上、下游引物各 0.5 μL，0.3 μL 10 umol/L 的 dNTPs，14.5 μL 雙蒸水。反應程序為：94℃預熱 2 min；94℃變性 30 s，適當退火溫度下 30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán) 30次；72℃延伸 5 min；12℃保存。

1.2.4 毛細管電泳的方法

PCR擴增結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)2000 r/min離心1 min，室溫放置2～3 min，開蓋后觀察，確定沒有氣泡后，在每個產(chǎn)物的液面上層覆蓋10 μL礦物油以防止樣品蒸發(fā)，按順序置于Qsep100全自動核酸蛋白分析系統(tǒng)的樣品托盤上，并設(shè)置電泳檢測參數(shù)進行毛細管電泳。本實驗中，檢測時采用將兩種PCR產(chǎn)物（片段大小可區(qū)分）各取10 μL混合的方法，以節(jié)省電泳及分型時間。電泳檢測參數(shù)為：6 kV進樣2 s，6 kV電泳5 min。電泳結(jié)束后，用Q-ANALYZER軟件對電泳結(jié)果進行分析與矯正，根據(jù)擴增產(chǎn)物分子量的大小差異，對每個個體的微衛(wèi)星基因座進行分型。

1.3 統(tǒng)計分析

用Cervus 3軟件allele frequency analysis程序來分析他們的非親排除率、觀測和期望雜合度、Hardy Weinberg均衡、無效等位基因頻率、多態(tài)信息含量、等位基因數(shù)等參數(shù)，并根據(jù)各位點的非親排除率計算累計非親排除率。用SimulLation of Parentage Analysis程序進行10000次模擬鑒定實驗，用Parentage Analysis程序?qū)颖具M行親權(quán)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 挑選的微衛(wèi)星引物

對試驗中10對引物的PCR結(jié)果進行檢測。檢測結(jié)果顯示全部穩(wěn)定清晰，且多態(tài)性表現(xiàn)良好。

2.2 遺傳參數(shù)分析

表1給出了10個微衛(wèi)星多態(tài)位點在草魚隨機個體中的遺傳參數(shù)分析結(jié)果。

由表1可知，所檢測的10個微衛(wèi)星標記中，有1個低度多態(tài)位點（PIC≤0.25），無中度多態(tài)位點（0.25＜PIC＜0.5），有 9個高度多態(tài)位點（PIC≥0.5）。10個微衛(wèi)星標記分析檢測得到了162個等位基因，其中等位基因數(shù)最少的為Cid0029，檢測到4個；等位基因數(shù)最多的為Cid0004，檢測到30個。每個微衛(wèi)星位點的平均觀測雜合度介于0.147～0.813之間，無效等位基因頻率均介于0.068 6～0.292 8之間；平均期望雜合度介于0.222～0.945之間。

2.3 遺傳多樣性統(tǒng)計結(jié)果

表2所示是親本草魚（F0）和子代草魚（F1）的遺傳多樣性變化。親本的平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.8067，平均期望雜合度（He）為0.831 8，平均觀測雜合度（Ho）為0.6568，平均每個位點有16.2個等位基因；子代的平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.821 7，平均期望雜合度（He）為 0.835 6，平均觀測雜合度（Ho）為0.590 7，平均每個位點有18.1個等位基因。

表1 10個微衛(wèi)星多態(tài)位點在草魚隨機個體中的遺傳參數(shù)分析

表2 子代和親本的多樣性

2.4 非親排除率統(tǒng)計結(jié)果

圖1給出了10個微衛(wèi)星位點的非親排除率。

由圖1可知，10個微衛(wèi)星位點，當兩個親本的基因型是未知時，單個非親排除率ne-1p在0.214～0.985之間，平均值為0.382 7；當一個親本基因型是已知時，另一個非親排除率ne-2p在0.12～0.912之間，平均值為0.263 3；非親親本組合的排除率ne-pp在0.025～0.839之間，平均值為0.140 2。由以上數(shù)據(jù)可知，低排除率的微衛(wèi)星位點被證明適用于親子鑒定。

2.5 模擬分析結(jié)果

模擬條件在親本已知和未知情況下，測定了親子鑒定的準確率、錯配率及置信度。當已知親本性別時，母本16個、父本14個、子代樣本10 000個，真實親本采樣率為100%，相關(guān)參數(shù)為：鑒定準確率為95%，錯配率為5%，置信度為95%，數(shù)據(jù)缺失率為0。當已知單獨母本時，相關(guān)參數(shù)為：鑒定準確率為100%，錯配率為0，置信度為96%。由模擬分析數(shù)據(jù)可知，在理想狀態(tài)下，親本的親子鑒定可用10個微衛(wèi)星位點表示，達到了較高的96%的置信度和100%的鑒定準確率。

2.6 實際鑒定結(jié)果

實際分析全部位點相關(guān)參數(shù)為：單獨母本已知情況下，鑒定成功率為97%，錯配率為3%，置信度為95%。該結(jié)果與模擬分析數(shù)據(jù)非常接近，說明鑒定結(jié)果具有可信性。因此，本試驗以母本作為家系分類的依據(jù)可將該群體分為9個半同胞家系。

3 討論

3.1 PCR體系的選擇

目前大多都使用多重PCR的研究方法，是多重PCR引物使用熒光標記的設(shè)計和篩選指標，通過這種方法可以建立多重PCR，由于不同引物的使用，使熒光標記引物呈現(xiàn)不同顏色，因此只需要考慮它們之間的相容性。本試驗在進行毛細管電泳時，采用類似于多重PCR技術(shù)原理，將兩種PCR產(chǎn)物混合，以便縮短基因分型時間，提高工作效率。因此，在PCR設(shè)計基本原則的基礎(chǔ)上只需考慮選取的各位點擴增的產(chǎn)物片段有一定間隔。

3.2 家系鑒定影響因素

對家系鑒定的主要影響因素有：1）在進行毛細管電泳過程中，機器運行時由于機器的封閉性，可能會導致溫度上升對結(jié)果造成一定影響。針對這一問題采用風扇降溫的方法，從而降低溫度對實驗的影響；2）在基因分型時要對原始數(shù)據(jù)進行校準，不然可能會造成遺漏。對于差距較大的數(shù)據(jù)，在其他條件不變的情況下需重新進行毛細管電泳，并重新校準機器，減少因試驗誤差而帶來的影響。

圖1 10個微衛(wèi)星位點的非親排除率

4 結(jié)論

近年來，微衛(wèi)星標記技術(shù)在水產(chǎn)原良種選育、種質(zhì)遺傳鑒定以及資源增殖與評價等多方面得到了研究和應用。家系選擇的本質(zhì)是基因型的選擇，是通過逐代富集優(yōu)勢基因型，以選育出純度較高的優(yōu)良性狀的目的基因，正確把握近親交配繁殖和建立品系是家系選擇的關(guān)鍵。通過一對一交配建立起家系，生育累積隱性基因百分比的增加，純合基因表達，增加隱性性狀的概率，從而加快了一些不良基因的消除，使累積良好品質(zhì)相關(guān)基因的概率大大提高，最終獲得經(jīng)濟性狀最好的品種。在家系的選擇過程中，準確的系譜信息可以有效地指導親本的選擇和保留，從而縮短育種周期，提高育種效率。

在本次試驗研究中，通過使用微衛(wèi)星標記來獲取草魚系譜信息時，置信水平能夠達到95%以上，說明本研究所選的微衛(wèi)星標記可在漁業(yè)生產(chǎn)及科研試驗中用于獲取草魚系譜信息，并可根據(jù)子代的相關(guān)性狀參數(shù)，對優(yōu)良品種的家系選育進行定向選擇和繁育，使原良種的生物性狀、生產(chǎn)性能更加適合漁業(yè)生產(chǎn)需要及市場需求，從而提高漁業(yè)生產(chǎn)的技術(shù)水平和水產(chǎn)品的市場競爭力，促進漁業(yè)經(jīng)濟的健康可持續(xù)發(fā)展。