王慧竹，陳 帥*，石 琳，韓 緒，張 龍，張 敏，徐麗華

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長春 130021）

月見草（Oenothera biennisL.）為柳葉菜科月見草屬1～2年或多年生草本植物，其原產(chǎn)于北美地區(qū)，在我國主產(chǎn)于東北三省[1]，月見草全身是寶，月見草揮發(fā)油可食用，花可提取芳香油，莖皮纖維可制繩，根是解熱、消炎的良藥，莖和葉有清熱解毒、鎮(zhèn)痛的功效[2-3]，種子可榨油食用和藥用，其中月見草油是其主要成分，主要由亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸多種脂肪酸和維生素等組成[4]，具有良好的降脂、降糖、減肥、抗炎、抗氧化、抗血栓功能[5-7]，對(duì)老年慢性疾病具有醫(yī)療保健作用。隨著對(duì)月見草油藥理作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，全世界對(duì)月見草油的需求也日益增長。目前對(duì)月見草油的研究主要集中在提取工藝、成分分析、藥理作用等方面[8-10]。

中藥指紋譜圖技術(shù)是指用色譜、光譜檢測(cè)方法獲得中藥成分的譜圖，然后對(duì)圖譜進(jìn)行“過濾”、簡化等加工處理，從而獲得穩(wěn)定和專屬的特征指紋圖譜，以此來控制藥材質(zhì)量[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)以月見草油為研究對(duì)象，采用氣相色譜法結(jié)合柱前甲酯衍生化法，建立不同產(chǎn)地月見草油的指紋圖譜，通過國家藥典委員會(huì)指紋圖譜評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的聚類分析和主成分分析，探討了不同批次月見草油差異的來源，以期為月見草油的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來源于不同產(chǎn)地的月見草藥材購自吉林各大藥材零售商，經(jīng)吉林化工學(xué)院陳帥副教授鑒定為月見草正品，月見草藥材的批次編號(hào)、批號(hào)及產(chǎn)地信息匯總情況見表1。

石油醚、環(huán)己烷（分析純）、對(duì)照品：γ-亞麻酸甲酯（批號(hào)：20110723，純度≥98%）、亞油酸甲酯（批號(hào)：20176307，純度≥98%）均由武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

表1 月見草來源及編號(hào)Table 1 Sources and number ofOenothera biennis

1.2 儀器與設(shè)備

FL 9720氣相色譜儀：浙江福立分析儀器有限公司；AUY220型電子分析天平：日本島津公司；HP-5毛細(xì)管氣相色譜柱：美國安捷倫科技有限公司；氫火焰離子化檢測(cè)器：浙江福立分析儀器有限公司；SHC型高純氫氣發(fā)生器、JK-5L型純凈空氣泵：山東賽克賽斯氫能源有限公司；BJ-100植物粉碎機(jī)：上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司；WSP-100恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-A水浴恒溫振蕩器：常州國旺儀器有限公司；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南長沙湘儀離心機(jī)廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化方法

GC9720色譜柱（0.25 mm×30 m×0.25 μm）；分流比30∶1；檢測(cè)器溫度280℃；載氣高純氮?dú)?；柱流?.5 mL/min；氫氣流量30mL/min；空氣流量300 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫箱溫度：在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過程中共篩選了3個(gè)升溫程序。

A：初始溫度50℃，保持2min，以10℃/min升溫至100℃，保持2 min，以15℃/min升溫至140℃，保持5 min，以8℃/min升溫至200℃，保持10 min。

B：初始溫度55℃，保持2min，以7℃/min升溫至120℃，保持3 min，以16℃/min升溫至180℃，保持5 min，以8℃/min升溫至220℃，保持12 min。

C：初始溫度55℃，保持3min，以5℃/min升溫至100℃，保持2 min，以20℃/min升溫至160℃，保持3 min，以3℃/min升溫至230℃，保持15 min。1.3.2供試品溶液制備方法

取自然晾干的月見草適量，粉碎，過50目篩，準(zhǔn)確稱量100 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加正己烷1 200 mL，水浴加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收溶劑，得月見草油。由于正己烷直接萃取的月見草提取液中可能會(huì)混有部分長鏈脂肪酸或不飽和脂肪酸，若直接進(jìn)氣相分析，會(huì)污染毛細(xì)柱，因此需將在進(jìn)樣前對(duì)其進(jìn)行衍生化，本文采用氫氧化鉀-甲醇溶液進(jìn)行脂肪酸甲酯化的方法進(jìn)行樣品處理，在處理過程中，分別對(duì)氫氧化鉀-甲醇溶液濃度、加入量、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察。具體操作為：取月見草油約50 mg，置于具塞離心試管中，加入5 mL正己烷中，然后分別加入濃度為（1 mol/L、2 mol/L、3 mol/L）的KOH甲醇溶液[14]（0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL），室溫振蕩反應(yīng)（2 min、3 min、5 min、10 min），以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，取上層有機(jī)相，置于10 mL容量瓶中，正己烷定容，搖勻，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱定γ-亞麻酸甲酯0.003 0 g、亞油酸甲酯0.005 0 g，分別置于兩個(gè)5 mL棕色容量瓶中，加正己烷溶解并定容至刻度，即得γ-亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；分別精密移取上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.4 mL，分別置于同一個(gè)5 mL容量瓶中，即得體積分?jǐn)?shù)分別為48 μL/mL和80 μL/mL的γ-亞麻酸和亞油酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，冷藏備用。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

指紋圖譜相似度計(jì)算采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”2012.130723版本，計(jì)算方法采用均值法；聚類分析采用SPSS20.0軟件，以月見草油指紋圖譜各共有峰面積為數(shù)據(jù)源，采用系統(tǒng)聚類中的組間連接方法，樣品距離度量采用平方Euclidean距離進(jìn)行計(jì)算；利用SIMCA 14.1軟件，以不同批次月見草油各共有峰的峰面積為自變量，進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

在柱溫箱溫度優(yōu)化過程中因C升溫程序的色譜圖中，各色譜峰分離度良好，色譜峰分布均勻，故最終選擇C升溫程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；供試品溶液甲酯化試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的色譜條件下，加入2 mol/L的KOH甲醇溶液1.0 mL，室溫振蕩反應(yīng)5 min，色譜峰較多、峰面積較大，且樣品處理時(shí)間合適，因此在供試品溶液制備過程中，采用向樣品溶液中加入2 mol/L的KOH甲醇溶液1.0 mL，室溫振蕩反應(yīng)5 min的方法進(jìn)行甲酯化。將表1中各批月見草藥材分別按“1.3.2”項(xiàng)下優(yōu)化出的最佳方法制備供試品溶液，并按“1.3.1”項(xiàng)優(yōu)化出的最佳色譜條件測(cè)定，記錄結(jié)果見圖1（圖中顯示樣品S4的色譜圖）。

2.2 月見草油指紋圖譜的建立

2.2.1 參比峰的選擇

通過氣相色譜法對(duì)10批月見草油進(jìn)行測(cè)定，在樣品的氣相色譜圖（圖1）中，亞油酸甲酯（4號(hào)峰）色譜峰的峰面積較大，與相鄰色譜峰的分離度較好，且為10批月見草油指紋圖譜所共有，因此，本研究將其設(shè)為參照峰，用以計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

圖1 月見草油樣品S4（A）和混合標(biāo)準(zhǔn)品（B）氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram ofOenothera biennisoil sample S4(A)and mix standards(B)

2.2.2 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

將所得的10批月見草揮發(fā)油GC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入中國藥典委員會(huì)研制的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版），建立了月見草揮發(fā)油GC指紋圖譜疊加模式色譜圖，結(jié)果如圖2所示。將10批月見草油按平均值法生成對(duì)照指紋圖譜，通過對(duì)各批次的指紋圖譜的相似度計(jì)算，結(jié)果見表2。

圖2 10批月見草油GC指紋圖譜疊加圖Fig.2 GC fingerprint superposition of 10 batches of Oenothera biennisoil

由圖2可知，以樣品S4藥材圖譜作為參照譜進(jìn)行指紋匹配，確定了8個(gè)共有峰。由表2可知，以10批月見草油按平均值法生成對(duì)照指紋圖譜相似度為1進(jìn)行計(jì)算，10批藥材的相似度在0.914～0.989范圍內(nèi)。

表2 10批月見草揮發(fā)油GC指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of GC fingerprint of the 10 batches of Oenothera biennisoil

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液（樣品S4），按“1.3.1”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，以4號(hào)峰（亞油酸甲酯）為參照峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別見表3和表4。

表3 相對(duì)保留時(shí)間的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of precision for relative retention time

表4 相對(duì)峰面積的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of precision for relative peak area

由表3可知，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜0.76%；由表4可知，相對(duì)峰面積的RSD＜1.60%，表明方法的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（樣品S5）溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳色譜條件，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以4號(hào)峰（亞油酸甲酯）為參照峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表5和表6。

表5 相對(duì)保留時(shí)間的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental results of stability for relative retention time

表6 相對(duì)峰面積的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Experimental results of stability for relative peak area

由表5、表6可知，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.96%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD＜1.85%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（樣品S4）月見草藥材5份，按“1.3.2”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳供試品溶液制備方法平行制備5份月見草油供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳色譜條件，依次測(cè)定，記錄色譜圖，以4號(hào)峰（亞油酸甲酯）為參照峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表7和表8。

表7 相對(duì)保留時(shí)間的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Experimental results of repeatability for relative retention time

表8 相對(duì)峰面積的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Experimental results of repeatability for relative peak area

由表7、表8可知，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.24%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD＜2.83%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.4 月見草油指紋圖譜的聚類分析

本研究以月見草油指紋圖譜各共有峰面積為數(shù)據(jù)源[15]，對(duì)10批月見草油的GC指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，采用系統(tǒng)聚類中的組間連接方法，樣品距離度量采用平方Euclidean距離，得到10批月見草油指紋圖譜的聚類分析樹狀圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3 10批月見草油指紋圖譜的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis tree for 10 batches ofOenothera biennisoil

聚類分析圖反映的是各樣品的相似程度，樣品間的分類距離值越小則樣品間的差異越小，反之則越大。由圖3可知，當(dāng)分類距離取10時(shí)，10批月見草樣品被分為2類，即Ⅰ和Ⅱ類，其中S4和S8為II類，其余樣品為I類。

2.5 主成分分析

以主成分特征值＞1作為選擇主成分的依據(jù)，獲得2個(gè)主成分，主成分分析結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，累計(jì)均方差為96.5%，表明引入的2個(gè)主成分可以表達(dá)96.5%的原變量信息，從圖4A中可以看出，10批樣本大致分為兩組，分別標(biāo)記為I和II。其中，S4和S8為II組，其余樣品為I組，由于S4和S8樣品來源分別為湖北巴東和江西吉水，而其余樣品均來自北方寒冷地區(qū)，結(jié)合分析結(jié)果，地理位置與氣候條件的差異對(duì)月見草質(zhì)量存在一定程度的影響。從圖4B中可以看出1，2，3，4，5，6號(hào)峰對(duì)PC1有較大的貢獻(xiàn)，而7，8號(hào)峰對(duì)PC2有較大的貢獻(xiàn)。

圖4 不同批次月見草油指紋圖譜的主成分分析結(jié)果Fig.4 Results of principle components analysis of fingerprint of oil fromOenothera bienniswith different batches

3 結(jié)論

在最優(yōu)的樣品處理方法和色譜條件下，建立了月見草油的指紋圖譜，經(jīng)方法學(xué)考察，該方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，均符合指紋圖譜規(guī)定要求。通過對(duì)指紋圖譜分析，確證了8個(gè)共有峰，10批月見草油的相似度為0.914～0.989。考慮到中藥這一復(fù)雜體系中的不同的化學(xué)物質(zhì)之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性，因此聚類分析和主成分分析被應(yīng)用于此研究中，并且聚類分析和主成分分析的結(jié)果一致，所選樣本在兩種方法下均被分成了兩類，同時(shí)主成分分析結(jié)果表明1、2、3、4、5、6號(hào)峰為影響月見草油指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的主要因素（累計(jì)方差為90.5%）。由于受實(shí)驗(yàn)條件所限，本實(shí)驗(yàn)只鑒定出4號(hào)峰和5號(hào)峰分別為亞油酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯，其它色譜峰代表的化學(xué)成分需進(jìn)一步研究。本研究建立的月見草油指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，為月見草油質(zhì)量控制提供了依據(jù)。