超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中雙氯芬酸鈉殘留

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(1. 北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102600； 2. 首都師范大學(xué)化學(xué)系，北京 100048)

雙氯芬酸鈉又名雙氯滅痛，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，是常用非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥[1，2]，通過抑制環(huán)氧化酶活性減少前列腺素的合成，同時可間接抑制白三烯的合成而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛及抗炎的作用[3]，在獸醫(yī)臨床上主要作為中小動物的解熱鎮(zhèn)痛藥，用于發(fā)熱、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛和風(fēng)濕痛等[4]。人體長期服用雙氯芬酸鈉口服制劑可造成胃腸刺激、神經(jīng)性頭痛及電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)[5]。歐盟規(guī)定雙氯芬酸鈉在牛和豬可食性組織中的殘留標(biāo)識物為雙氯芬酸，在牛奶中最大殘留限量(MRL)為0.1 μg/kg[6]，我國尚未批準(zhǔn)該制劑用于獸醫(yī)臨床[7]。

圖1 雙氯芬酸鈉化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前，雙氯芬酸鈉檢測方法主要有液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10，11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]及毛細(xì)管電泳法等。液相色譜法抗干擾能力差且靈敏度不能滿足檢測要求；氣相色譜法樣品衍生化前處理繁瑣且會帶來副反應(yīng)。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于無需對樣品進(jìn)行衍生化處理，且分析時間短，靈敏度高，重現(xiàn)性好，將是未來雙氯芬酸鈉殘留檢測的發(fā)展方向。

本實(shí)驗(yàn)建立了牛奶中雙氯芬酸鈉殘留測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI 公司)；氮吹儀(Organomation Associates 公司)；溶劑過濾器(美國PALL公司)；旋渦混合儀(德國IKA公司)等。

1.1.2 試劑

雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素標(biāo)記物均購自德國Dr公司，純度≥98.0%；乙腈、甲醇，色譜純，甲酸，質(zhì)譜級，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯、正己烷、氯化鈉，分析純，均購自北京化工試劑廠。其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛奶樣品前處理

取供試樣品10 g±0.5 g于50 mL離心管中，加入100 μL雙氯芬酸鈉13C同位素標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)工作液，高速渦旋1 min，靜置10 min；加入10 mL乙腈及1 g乙酸銨，高速渦旋2 min，4℃下4500 r/min離心20 min。取上清液轉(zhuǎn)入15 mL帶蓋聚丙烯離心管中，加入乙腈飽和過的正己烷3 mL，渦旋混勻1 min，4℃下4500 r/min離心10 min，棄去上層正己烷和下層水相；乙腈提取液于50℃下濃縮至干，加入1 mL流動相，渦旋振蕩并水浴超聲，使殘?jiān)耆芙猓瑯悠愤^0.22 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.2 液相色譜參考條件

液相色譜條件：C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水(55+45)；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：室溫。

1.2.3 質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧(ESI)離子源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描方式：正離子掃描；電離電壓：3.0 kV；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：800 L/h。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取適量雙氯芬酸鈉標(biāo)品，用乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL貯備液，再用乙腈稀釋配制5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.05、0.1、0.5、3.0、5.0 ng/mL)，以雙氯芬酸鈉特征離子質(zhì)量色譜峰面積對雙氯芬酸鈉13C同位素標(biāo)記物(內(nèi)標(biāo))特征離子質(zhì)量色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，空白試料加標(biāo)后被測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

采用C18反相色譜柱可使雙氯芬酸鈉較好分離，本研究結(jié)果表明柱長50 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm, 粒度1.7 μm，C18反相色譜柱對雙氯芬酸鈉分離效果最好。以乙腈-0.1%甲酸水(55+45)作為流動相，進(jìn)樣量5 μL，流速0.3 mL/min。結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水做流動相對雙氯芬酸鈉有良好的色譜分離效果，可兼顧質(zhì)譜響應(yīng)，色譜峰峰形較優(yōu)。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)雙氯芬酸鈉含有羧基的特點(diǎn)，可在酸性條件下用正離子模式檢測，一級全掃描質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰([M+H]+)為296，可以看出雙氯芬酸鈉在酸性溶液中掉了個[Na+]，加了個[H+],調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓，錐孔電壓，使其豐度最大，進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，選擇離子中豐度最大的兩個離子作為定量和定性離子，對各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，質(zhì)譜參數(shù)條件如表1。

表1 雙氯芬酸鈉及其同位素標(biāo)記物定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍

在最佳色譜條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度0.05、0.1、0.5、3.0、5.0 ng/mL，雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，在0.05～5 ng/mL濃度范圍內(nèi)雙氯芬酸鈉色譜峰面積與濃度呈良好線性相關(guān)，回歸方程：y= 0.9654x+0.0214；相關(guān)系數(shù)R2為0.9996。

2.3.2 檢測方法靈敏度

方法檢測限(LOD)和定量限(LOQ)：按照藥物選擇離子響應(yīng)色譜峰信噪比S/N>3(按PtP算)確定檢測限；按照藥物選擇離子響應(yīng)色譜峰的信噪比S/N>10(按PtP算)確定定量限。

添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 g空白牛奶中，分別制備得到0.02 μg/kg和0.05 μg/kg的添加樣品，按檢測步驟處理樣品、檢測。結(jié)果表明，牛奶中雙氯芬酸鈉檢測限(LOD)為0.02 μg/kg，定量限(LOQ)為0.05 μg/kg。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

選取空白樣品進(jìn)行空白添加實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度，標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)牛奶和實(shí)際牛奶樣品中雙氯芬酸鈉MRM色譜圖見圖3～圖5。添加濃度為0.05、0.1、2.0 μg/kg，每個濃度設(shè)5個平行，連續(xù)做3天，計(jì)算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。在三個濃度添加水平下，平均回收率為97.6%～113.0%，日內(nèi)變異系數(shù)0.5%～9.5%，日間變異系數(shù)1.8 %～7.4 %。方法回收率高，精密度好，檢測方法準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果見表2。

表2 牛奶中雙氯芬酸鈉添加回收率和變異系數(shù)(n=5)

圖3 雙氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(MRM)色譜圖(2.0 ng/mL)

圖4 雙氯芬酸鈉牛奶添加MRM色譜圖(0.2 μg/kg)

圖5 牛奶中雙氯芬酸鈉MRM色譜圖

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了牛奶中雙氯芬酸鈉殘留的快速檢測方法，對液相色譜、質(zhì)譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，該方法快速、簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，回收率高且穩(wěn)定；適用于雙氯芬酸鈉定性定量分析。