生物環(huán)境中能提取到DNA嗎

龔佐山

(安徽省六安市霍邱縣第一中學(xué) 六安 237400)

1 問題的由來

DNA的結(jié)構(gòu)和DNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成等是高中生物學(xué)教學(xué)的重要知識內(nèi)容。根據(jù)DNA的分布，有核DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、端粒DNA；根據(jù)DNA的形狀，可分為線狀DNA、環(huán)狀DNA、單鏈DNA、雙鏈DNA；根據(jù)DNA的來源和作用，有cDNA、質(zhì)粒DNA、探針DNA等。DNA主要分布在細(xì)胞核中或擬核中，儲存著遺傳信息，控制生物體或細(xì)胞的遺傳和代謝。教材中“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”“DNA的粗提取與鑒定”等實驗都選用了活細(xì)胞作為實驗材料。同時，教材中也指出“DNA指紋法在案件偵破工作中有重要的用途。刑偵將從案發(fā)現(xiàn)場得到的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進(jìn)行比較，就有可能為案件的偵破提供證據(jù)”，并提出問題：“利用已滅絕的生物的DNA分子，真的能夠使滅絕的生物復(fù)活嗎？”對此，有些學(xué)生對在生物的生活環(huán)境中能否提取到DNA有疑惑，認(rèn)為DNA是細(xì)胞內(nèi)的分子，毛發(fā)主要成分是蛋白質(zhì)，從毛發(fā)中能提取到DNA嗎？恐龍早在白堊紀(jì)末期全部滅絕，能夠在恐龍化石中提取到DNA嗎？

2 環(huán)境DNA

環(huán)境DNA(environmental DNA，簡稱eDNA)的概念是在20世紀(jì)80年代末期提出的。eDNA是指從多樣的環(huán)境樣本(如土壤、沉積物、空氣、水體等生物生活環(huán)境)中采集到的DNA，而不是直接從生物個體組織細(xì)胞獲得的[1]。環(huán)境樣本中通常含有動植物脫落的細(xì)胞或者是游離的DNA，包括生物排泄的尿液、糞便、黏液，脫落的皮膚，生物的遺跡遺體形成的化石等。這些環(huán)境樣本不僅是“eDNA”的來源，還能提供一個環(huán)境系統(tǒng)中物種的存在狀況。環(huán)境中DNA濃度對物種存在與否、物種的分布、物種的生物量、豐富度情況等可提供重要的參數(shù)[2]。例如，某種魚在水體環(huán)境中活動時，會在環(huán)境中留下eDNA，若能在水體環(huán)境樣本中提取到某種魚的eDNA，則說明在某個時期該種魚曾經(jīng)來過或生活在這樣的環(huán)境中。

3 從環(huán)境樣本中提取到eDNA的可能性

從環(huán)境樣本中之所以能提取到DNA，這與DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及環(huán)境中的DNA酶失活有關(guān)。①DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。組成DNA的兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞形成雙螺旋特定空間結(jié)構(gòu)，DNA分子磷酸殘基上的負(fù)電荷可與介質(zhì)中的陽離子之間形成離子鍵，從而消除了兩條鏈之間由于負(fù)電荷的相互作用而排斥的情況，使DNA分子空間結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定；DNA分子兩條鏈通過堿基互補(bǔ)配對形成氫鍵，盡管單個氫鍵作用力非常微弱，但由于DNA分子是高分子聚合物，分子內(nèi)部具有很多堿基對，在DNA分子內(nèi)部形成大量氫鍵，從而維持了雙螺旋空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；組成DNA分子的堿基是疏水性的，在形成DNA分子時，由于疏水作用堿基在DNA分子中縱向?qū)訉佣逊e，形成堿基堆積力，這種堿基堆積力是DNA分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素。②環(huán)境中的DNA酶容易失活。DNA酶如生物遺留在生活環(huán)境中的其他有機(jī)物那樣，因環(huán)境的改變而使酶活性降低或失活，并很快被環(huán)境中的微生物降解。由于缺少了DNA酶的降解作用，從而使eDNA得以長時間穩(wěn)定存在，為從環(huán)境樣本中提取到eDNA提供了可能。例如，帶有毛囊的毛發(fā)在很長時間內(nèi)可以提取到DNA，在毛干中可以提取到線粒體DNA；古化石中的DNA與氧氣隔絕，使得化石中DNA得以長期穩(wěn)定存在。

4 環(huán)境樣本的采集

4.1 環(huán)境DNA樣本的采集 eDNA樣本的采集通常源于水體、土壤和糞便等。從溪流、河水和海水中采集水樣，一般樣本量為1～2L[3]，水樣的采集通常采用濾膜法或沉淀法。①濾膜法： 通過該法過濾大量的水收集DNA，以增加可溶性DNA的收集量。應(yīng)用直徑為47mm、孔徑為0.45μm的硝酸纖維素?zé)o菌過濾膜對水進(jìn)行一次性過濾。然后將濾膜放置在無菌的2mL小瓶中，加入無水乙醇放置于-20℃保存?zhèn)溆?。②沉淀法?通常用于物種監(jiān)測為目的eDNA水樣采集。首先，對預(yù)設(shè)好的環(huán)境生物樣本采集樣地用GPS定位，在不同的地點3次取樣以提高水樣中的物種覆蓋度，增加物種檢測概率，用塑料量筒量取15mL的水樣，并加入1.5mL的3mol/L醋酸鈉和33.5mL的無水乙醇于50mL的無菌離心管中，置于-20℃冰箱保存，以備實驗室對eDNA進(jìn)行提取和分析。醋酸鈉有保護(hù)DNA的作用，使樣品在室溫下能保持穩(wěn)定幾個小時甚至幾天。采取水樣過程中始終佩戴一次性無菌手套，每采樣一次及時更換手套。記錄取樣地點的生物環(huán)境特征，如采樣的時間、天氣、GPS定位的經(jīng)緯度、生境的主要外貌以及水流狀況等。季節(jié)、溫度變化及地理位置對eDNA濃度具有一定程度的影響。

對于從土壤中采集DNA樣本，由于研究區(qū)域的生物分布具有異質(zhì)性，隨機(jī)或有規(guī)律地采集來自不同深度的土樣，每個取樣地點應(yīng)該至少收集兩份樣品，每份樣品應(yīng)將取樣地點不同深度的土樣混合。

4.2 環(huán)境DNA的提取 對eDNA的提取方法有多種，如氯仿萃取法、細(xì)胞溶解的物理破碎法、二氧化硅提取法、試劑盒法[4]等。例如，利用QIAGEN DNA試劑盒可純化長達(dá)50kb的DNA片段[5]。具體方法如下： ①從50mL的無菌離心管中轉(zhuǎn)移200μL樣品到試劑盒中(試劑盒含有優(yōu)化的緩沖液，能有效裂解樣本使DNA與蛋白質(zhì)分離，穩(wěn)定核酸并促進(jìn)DNA選擇性結(jié)合到QIAGEN硅膠膜上)；②將無水乙醇加入到裂解物中，并上樣到QIAGEN離心柱上；在4℃下，8000～15000轉(zhuǎn)/min離心；③用洗滌緩沖液去除雜質(zhì)，再用低鹽緩沖液洗脫出DNA，然后用70%的冰凍乙醇洗滌沉淀DNA 3次，干燥處理；④用100μL的TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到eDNA提取液；⑤eDNA可通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳分離后，再用于后續(xù)的研究。

5 環(huán)境DNA的應(yīng)用

eDNA最初應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域，隨著研究的深入，進(jìn)一步發(fā)展到DNA物種鑒定、植食性動物的食性分析等方面的研究。目前，在DNA條形碼的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的eDNA條形碼技術(shù)在生物多樣性研究、物種監(jiān)測、外來入侵物種檢測等方面都有較好的應(yīng)用前景。