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      人類BRAF 基因突變檢測(cè)試劑盒性能評(píng)價(jià)

      2018-08-15 05:51:56游延軍胡澤斌蒲小聰楊達(dá)梅龍騰鑲高飛
      關(guān)鍵詞:重復(fù)性基因突變符合率

      游延軍,胡澤斌,蒲小聰,楊達(dá)梅,龍騰鑲,高飛

      作者單位:611731 成都,四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院(游延軍、蒲小聰);611731 成都,邁克股份有限公司(楊達(dá)梅、龍騰鑲);100050 北京,中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室(胡澤斌、高飛)

      BRAF 基因位于 7q34,長(zhǎng)約 190 kb,編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。該激酶是 RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 信號(hào)通路最為關(guān)鍵的激活因子,參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡等[1]。BRAF 基因主要有兩種突變類型:11% 的突變發(fā)生在編碼甘氨酸環(huán)的 11 號(hào)外顯子上,如 G463、G465、G468 等點(diǎn)突變;89% 的突變發(fā)生在編碼激活區(qū)的15 號(hào)外顯子上,其中 80% ~ 90% 的突變位于第 1799號(hào)堿基上,T 突變?yōu)?A(T1799A),導(dǎo)致其編碼的纈氨酸被谷氨酸取代(V600E)[2]。在多種人類惡性腫瘤中,如惡性黑色素瘤[3]、結(jié)直腸癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]、甲狀腺癌[6]等均存在不同比例的 BRAF 突變。研究表明,BRAF 基因發(fā)生V600E 突變時(shí),病患無法從抗 EGFR 的相關(guān)靶向藥物的治療中獲益,而且還可導(dǎo)致部分 KRAS 基因野生型患者對(duì)EGFR 靶向藥物治療不敏感[7]。在腫瘤個(gè)性化治療高速發(fā)展的現(xiàn)在,檢測(cè) BRAF 基因 V600E 的突變狀態(tài),能夠?yàn)榕R床醫(yī)生對(duì)腫瘤患者制定個(gè)性化治療方案提供很好的依據(jù),提高患者的生存率,減少盲目用藥,減少病患家庭的經(jīng)濟(jì)壓力。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 樣本 本研究的樣本是采用石蠟包埋組織提取的核酸樣本經(jīng)標(biāo)化制備的企業(yè)參考品,保存條件為 –10 ~ –30 ℃。

      1.1.2 儀器和試劑 評(píng)價(jià)試劑為 A 公司的人類 BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法),擴(kuò)增分析儀器采用美國(guó) ABI 公司的 7500 熒光定量 PCR 儀;對(duì)比試劑為經(jīng)過國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理部門審批的已上市的 B 公司的人類 BRAF 基因 V600E 突變檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR法)。

      1.2 方法

      1.2.1 準(zhǔn)確性 檢測(cè)人類 BRAF 基因突變經(jīng)標(biāo)化的陽性企業(yè)參考品 P1 ~ P3,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為突變陽性。

      1.2.2 特異性 檢測(cè)人類 BRAF 基因突變經(jīng)標(biāo)化的陰性企業(yè)參考品(野生型人類基因組)N1 ~ N4,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為野生型;檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍外的人類 BRAF 基因突變經(jīng)標(biāo)化的企業(yè)參考品 N5 ~ N9,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為未檢出突變;檢測(cè)非人類基因組樣本 N10,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為未檢出突變。

      1.2.3 最低檢測(cè)限 10 ng 野生型人類基因組背景下,對(duì)突變比例為 1.0% 的 BRAF 基因 V600E 突變參考品 L1進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為突變陽性。

      1.2.4 重復(fù)性 陰性參考品(野生型)R1,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)均為野生型;陽性參考品 R2 ~ R3,檢測(cè)應(yīng)為突變陽性且 Ct值批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)應(yīng)不大于 5.0%。

      1.2.5 抗干擾能力 將弱陽性企業(yè)參考品 L1(10 ng 野生型人類基因組背景下,突變比率低至 1%),平均分成 3 組,向樣本中分別加入等體積不同濃度的蛋白酶 K、甲醛和乙醇,同時(shí)采用純化水加入樣本作為對(duì)照,判斷是否存在干擾,Ct 均值差異 ≤ 1.0 為無干擾,Ct 均值差異 > 1.0 為有干擾。

      1.2.6 臨床比對(duì) 分別用 A 公司人類 BRAF 基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR法)和 B 公司比對(duì)試劑盒檢測(cè)相同的臨床樣本 156 例,進(jìn)行兩個(gè)試劑盒的一致性評(píng)價(jià)。

      2 結(jié)果

      2.1 準(zhǔn)確性

      陽性企業(yè)參考品 P1、P2、P3,每個(gè)參考品重復(fù)一次,檢測(cè)結(jié)果見表 1,根據(jù)判定規(guī)則(下同):ΔCt = Ct體系II–Ct體系I,若 ΔCt ≤ 9,表明樣本為 BRAF 基因 V600E 突變陽性;若 ΔCt > 9,表明樣本為 BRAF 基因 V600E 突變陰性。檢測(cè)結(jié)果均為突變陽性。

      表 1 陽性企業(yè)參考品檢測(cè)結(jié)果

      2.2 特異性

      陰性企業(yè)參考品(N1 ~ N10),每個(gè)參考品重復(fù) 1 次,檢測(cè)結(jié)果見表 2,檢測(cè)結(jié)果均為野生型或未檢出突變。

      2.3 最低檢測(cè)限

      10 ng 野生型人類基因組背景下,對(duì)突變比例為 1.0%的 BRAF 基因 V600E 突變參考品(L1)進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)3 次,檢測(cè)結(jié)果見表 3,檢測(cè)結(jié)果均為突變陽性。

      表 2 陰性企業(yè)參考品檢測(cè)結(jié)果

      表 3 最低檢測(cè)限企業(yè)參考品檢測(cè)結(jié)果

      2.4 重復(fù)性

      2.4.1 重復(fù)性企業(yè)參考品 R1 連續(xù)檢測(cè)重復(fù) 10 次,檢測(cè)結(jié)果如表 4,檢測(cè)結(jié)果均為野生型。

      表 4 重復(fù)性企業(yè)參考品 R1

      表 5 重復(fù)性企業(yè)參考品 R2

      表 6 重復(fù)性企業(yè)參考品 R3

      2.4.2 重復(fù)性企業(yè)參考品 R2 連續(xù)檢測(cè)重復(fù) 10 次,檢測(cè)結(jié)果見表 5,檢測(cè)結(jié)果為突變陽性且對(duì)應(yīng)體系 Ct 值批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)分別為 0.27%、0.68%;重復(fù)性企業(yè)參考品 R3,連續(xù)檢測(cè)重復(fù) 10 次,檢測(cè)結(jié)果見表 6,檢測(cè)結(jié)果為突變陽性且對(duì)應(yīng)體系 Ct 值批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)分別為 0.19%、0.65%。

      2.5 抗干擾能力

      2.5.1 蛋白酶 K 的殘留含量對(duì)試劑擴(kuò)增的影響 在擴(kuò)增樣本中加入等體積的不同濃度的蛋白酶 K,使反應(yīng)體系中終濃度為 0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%,檢測(cè)結(jié)果如表 7,終濃度高于 0.0075% 蛋白酶 K 殘留會(huì)影響試劑擴(kuò)增。

      2.5.2 甲醛的殘留含量對(duì)試劑擴(kuò)增的影響 在擴(kuò)增樣本中加入等體積的不同濃度的甲醛,使反應(yīng)體系中終濃度為0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%,檢測(cè)結(jié)果如表 8,終濃度高于 0.075% 的甲醛殘留會(huì)影響試劑擴(kuò)增。

      表 7 蛋白酶 K 的殘留量對(duì)擴(kuò)增的影響

      表 8 甲醛的殘留量對(duì)擴(kuò)增的影響

      2.5.3 乙醇的殘留含量對(duì)試劑擴(kuò)增的影響 在擴(kuò)增樣本中加入等體積的不同濃度的乙醇,使反應(yīng)體系中終濃度為0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%,檢測(cè)結(jié)果如表 9,終濃度高于 0.75% 的乙醇?xì)埩魰?huì)影響試劑擴(kuò)增。

      表 9 乙醇的殘留量對(duì)擴(kuò)增的影響

      2.6 臨床比對(duì)

      使用 156 例臨床石蠟包埋組織樣本比較 A 公司人類BRAF 基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)和比對(duì)試劑盒進(jìn)行符合性分析,計(jì)算陽性符合率、陰性符合率、總符合率及 Kappa 系數(shù),檢測(cè)結(jié)果如表 10。

      表 10 同類產(chǎn)品比較結(jié)果

      對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合性分析,陽性符合率為100.00%,陰性符合率為 99.15%,總符合率為 99.37%,Kappa 系數(shù)為 0.98。表明兩種方法具有高度一致性。

      3 討論

      本產(chǎn)品以實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)和引物特異性 PCR(ARMS)技術(shù)為平臺(tái),特異性檢測(cè) DNA 樣本中的 BRAF基因 V600E 突變。其中,試劑 1 中的特異性引物能夠在Taq 酶作用下靶向擴(kuò)增 BRAF 基因野生型和突變型模板;試劑 2 中的特異性引物在 Taq 酶作用下只擴(kuò)增突變型模板。通過兩者 Ct 差值實(shí)現(xiàn) BRAF 基因 V600E 突變的定性檢測(cè)。

      ARMS-PCR 是目前實(shí)驗(yàn)室常用的基因突變檢測(cè)方法,主要優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)靈敏度高,可檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中突變比例為1% 甚至更低的突變基因[8]。

      通過對(duì) A 公司人類 BRAF 基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)可知,該產(chǎn)品具有重復(fù)性好,靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn),滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和市場(chǎng)需求。

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