姚詩源，郭光光，周修佩，任 超，黃國勇，胡紅青

（華中農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，武漢 430070）

上世紀以來，全球工業(yè)化導(dǎo)致重金屬的釋放量急劇增加，銅礦開采導(dǎo)致礦區(qū)周邊土壤的銅含量極高[1]。銅是植物必需營養(yǎng)元素，但過量時會干擾植物光合作用，增大細胞膜透性，減緩細胞分裂，抑制其他養(yǎng)分吸收，甚至引起死亡[2]。人體攝入銅過量會引起低血壓等銅代謝疾病[3]。

植物提取是去除土壤重金屬的有效方法，具有成本低、去除徹底和景觀美學作用，是一種應(yīng)用前景廣闊的重金屬修復(fù)手段[4]。已發(fā)現(xiàn)的銅超積累植物有海州香薷 (Elsholtzia splendens)、鴨跖草 (Commelina communis)、矮石蕊 (Cladonia humilis) 等[5–6]，它們普遍生物量小、生長緩慢，吸收積累銅量有限，收獲物經(jīng)濟價值不高。

蓖麻是重要的工業(yè)原料[7]，同時具有較高的土壤重金屬污染修復(fù)價值，對Cu、Cd、Zn等重金屬有較高的耐性[8]，能在高濃度銅污染土壤上正常生長[9]。Huang等[10]水培發(fā)現(xiàn)，在750 μmol/L銅處理下，蓖麻根部銅濃度可達14587 mg/kg，Olivares等[11]發(fā)現(xiàn)蓖麻生長在金屬礦區(qū)土壤上，籽粒產(chǎn)油率更高，具有修復(fù)土壤銅污染的潛力。但作為土壤銅污染修復(fù)植物，蓖麻與其他耐性植物一樣，仍具有一定的局限性，如銅的轉(zhuǎn)運系數(shù)較低、生長周期慢等。

施肥既可促進植物生長，又可影響土壤性質(zhì) (如酸堿性) 和重金屬的形態(tài)，提高植物修復(fù)效率[12]。研究發(fā)現(xiàn)，NH4+-N能顯著增加土壤中Pb、Cd的生物有效性[13]，NO–3-N能促進Pb從魚腥草地下部向地上部轉(zhuǎn)移[14]。磷肥可促進植物早期根系的形成和生長，增強植物抗性[15]，在含銅100 mg/kg的土壤中施用80 kg/hm2P2O5可使油芥菜生物量增大31%[16]，施磷可增加水稻對鎘的吸收但緩解毒性癥狀[17]，黃化剛等[18]研究表明4種磷肥 [KH2PO4、Ca(H2PO4)2、NaH2PO4和NH4H2PO4] 對東南景天吸收重金屬均有促進作用。

氮、磷肥對植物吸收積累銅的影響的試驗多在人工添加銅土壤上進行，對原位重金屬污染土壤的研究較少。氮、磷肥施用在農(nóng)作物增產(chǎn)領(lǐng)域研究較多，但在植物修復(fù)領(lǐng)域研究較少。本試驗希望找到既促進蓖麻生長、又增加蓖麻吸收積累銅量的最佳施肥組合，并探索施肥對蓖麻吸收銅的影響及作用機制，為土壤銅污染修復(fù)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1 試驗材料 供試植物為蓖麻 (Ricinus communis L.)，種子采自湖北省大冶市銅綠山鎮(zhèn)銅礦坑周邊，在華中農(nóng)業(yè)大學溫室培育并開展盆栽試驗。供試土壤采自礦坑，風干、磨碎、裝盆。土壤基本理化性質(zhì)為：pH 8.36、有機質(zhì) 9.74 g/kg、全氮 0.57 g/kg、堿解氮 22.34 mg/kg、速效鉀 19.23 mg/kg、有效磷0.43 mg/kg、土壤總銅含量 1249.7 mg/kg，其中弱酸提取態(tài) 3.4 mg/kg、可還原態(tài) 371.8 mg/kg、可氧化態(tài)195.1 mg/kg、殘渣態(tài) (銅總量減去其他形態(tài)銅含量)679.4 mg/kg。

1.1.2 盆栽試驗 供試肥料為 NH4NO3和 NaH2PO4，分析純試劑 (國藥集團化學試劑有限公司)。設(shè)置N 0、75、150、300 mg/kg 4 個水平 (用 N0、N75、N150、N300表示)，P 0、20、80、200 mg/kg 4 個水平 (用P0、P20、P80、P200表示)，進行雙因素4水平完全隨機設(shè)計，施肥處理包括 N0P0、N75～N300、P20～P200以及9個氮磷配施組合。將肥料溶解后均勻噴灑到1.5 kg土壤中，充分混勻后裝盆 (直徑上口15.5 cm、底部10.5 cm、高13.4 cm)，另取部分土壤不種植蓖麻，其余管理 (施肥、水分、溫度等) 與植株培養(yǎng)相同。每盆3棵植株，每個處理3次重復(fù)。

1.1.3 植株種植與收獲 在云母基質(zhì) (添加有機物 35 g/kg) 中育苗，待植株長出2片真葉后，挑選長勢一致的幼苗用蒸餾水洗凈、移栽。將移栽盆放于溫室中 (濕度 40%) 培養(yǎng)，設(shè)置白天 14 h，30℃；夜間 10 h，20℃。每日定時澆水至田間持水量的60%，2個月后收獲。用不銹鋼剪刀將植物根、莖、葉分開，蒸餾水洗凈、吸干，分別裝入牛皮紙袋中，105℃殺青30 min，65℃烘至恒重。烘干植株樣粉碎，用于Cu含量的測定。采集種植和未種植的全部土壤，研磨過20目和100目尼龍篩，分別用于測定基本理化性質(zhì)和Cu含量。

1.2 測定方法

1.2.1 植株生長指標及 Cu 含量 收獲前2天對植株的6片成熟葉片距葉基部1/2處使用葉綠素儀(SPAD-502) 測定，取平均值作為該株的最終SPAD值。植物Cu含量采用HNO3–HClO4消煮法，稱取0.2000 g植株樣品于消化管中，加入10 mL混合酸 (7.5 mL HNO3+ 2.5 mL HClO4)，在遠紅外消煮爐上390℃消煮至溶液澄清，超純水定容，過濾后用原子吸收分光光度計 (Varian AA-240FS) 測定[19]。

1.2.2 土壤基本理化性質(zhì)及 Cu 形態(tài)分級 土壤基本理化性質(zhì)測定參照《土壤農(nóng)化分析》[20]。土壤pH采用pH計測定，土水比1∶2.5。土壤有機質(zhì)用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定。Cu總量用王水消化，原子吸收分光光度計 (Varian AA-240FS) 測定。用 BCR 形態(tài)分級法提取不同形態(tài)Cu[21]，即弱酸提取態(tài)用0.11 mol/L HOAc浸提，可還原態(tài)用0.5 mol/L鹽酸羥胺浸提，可氧化態(tài)用H2O2–NH4OAc浸提，提取液用原子吸收分光光度計 (Varian AA-240FS) 測定 Cu 含量。

質(zhì)量控制：在樣品分析過程中進行方法空白、基質(zhì)加標、平行樣以及加標回收測定。添加標準物質(zhì)灌木枝葉 (GBW07603) 進行植物Cu含量質(zhì)量控制。

1.3 數(shù)據(jù)分析及制圖

采用EXCEL2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理，采用SPSS20.0進行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan法進行平均數(shù)間差異顯著性檢驗，采用Origin9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理下蓖麻生長情況

表1可以看出，N150P20和N75P80處理蓖麻的SPAD值低于N0P0處理，其余處理均能增加SPAD值。氮、磷肥單施時SPAD值隨施肥量增加而增加，N0P200和N300P0處理SPAD值最高，分別比N0P0處理增加13.6%和15.7%。兩種肥料配施，施氮量為150和300 mg/kg時，SPAD值隨施磷量增加先減少后增加，施氮量為75 mg/kg時，SPAD值隨施磷量增加呈先增加后減少；施磷量為20 mg/kg時，N150P20處理SPAD值最低，與N75P20、N300P20處理差異顯著，當施磷量為80和200 mg/kg時，SPAD值隨施氮量增加而增加，N300P200處理最高，為N0P0處理的1.23倍。氮磷肥的交互作用顯著，SPAD值在低量配施時出現(xiàn)波動，在高量配施時一直增長。施用高量氮、磷肥能顯著提高蓖麻SPAD值。

表2顯示，氮、磷肥單施時蓖麻根重隨施肥量增加先增加后減少，N75P0處理根重最大且與其他處理差異顯著。氮磷肥交互作用顯著，配施時高量氮肥處理根重均低于N0P0處理。N75P200處理蓖麻的根重顯著高于其他組合，是N0P0處理的1.50倍。單施氮、磷肥時，蓖麻莖重、葉重的變化與根重變化一致，N0P20處理莖重、葉重最大且與其他處理差異顯著。氮磷肥交互作用顯著，氮、磷肥配施時，蓖麻莖重隨施磷量增加緩慢增加，蓖麻葉重增加明顯。N0P20、N75P200處理蓖麻莖重最大且與其他處理差異顯著，分別是N0P0處理的2.01、1.91倍。N150P20、N300P20處理蓖麻莖重低于N0P0處理。但低磷與氮肥配施葉重低于單施氮、磷肥處理。N0P20、N75P200處理蓖麻葉重最大且與其他處理差異顯著，分別是N0P0處理的1.82、1.94倍。單施氮、磷肥時蓖麻總重相對于不施肥處理都有增加，但蓖麻總重隨著氮肥用量增加而減少，N300P0處理與N0P0處理差異不顯著；N0P200處理顯著增大了蓖麻干重，其他處理與N0P0處理間沒有差異。

表1 不同施肥處理下蓖麻葉片SPAD值Table1 SPAD values of castor leaves under different fertilization

顯然，氮、磷的施用對蓖麻地上部生物量的增加效果顯著，但對蓖麻根系生長促進效果不明顯，甚至有些處理抑制了蓖麻根系的生長。

2.2 不同施肥處理下蓖麻銅濃度

表3顯示，所有施肥處理蓖麻根部Cu濃度均高于N0P0處理，其中N300P20處理根部Cu濃度最高，達175.2 mg/kg，比N0P0處理高287.6%。單施氮肥，蓖麻根部Cu濃度比N0P0處理高33.1%～84.5%，差異顯著；單施磷肥，蓖麻根部Cu濃度比N0P0處理高40.8%～68.1%，差異顯著。氮肥用量為75 mg/kg時，蓖麻根部Cu濃度隨磷肥用量增加先升高后降低；磷肥用量為20 mg/kg時，蓖麻根部Cu濃度隨施氮量增加而升高，施磷量為80和200 mg/kg時，根部Cu濃度隨氮用量增加先升高后降低。單施氮肥，莖部Cu濃度隨施氮量增加而增加，高量時與N0P0處理差異顯著。N0P20、P20N75處理蓖麻莖部Cu濃度最高，分別比N0P0處理高95.3%、92.5%。P20N150、P80N150、P200N75處理蓖麻莖部Cu濃度僅3.00～3.84 mg/kg，低于N0P0處理。磷肥用量為20 mg/kg時，莖部Cu濃度隨氮用量增加先升高后顯著降低，而磷濃度為200 mg/kg時，莖部Cu濃度隨氮肥用量增加先降低后升高。除N75P0、N0P20處理蓖麻葉部Cu濃度高于N0P0處理外，其他處理葉部Cu濃度均低于N0P0處理。蓖麻葉部Cu濃度隨施氮量和施磷量增加而降低。氮磷配施除N300P20處理，其他處理葉部Cu濃度都顯著低于單施氮肥；除P80與氮肥配施外，P20、P200與氮肥配施處理葉部Cu濃度均顯著低于單施磷肥。

總體來看，氮、磷肥能提高蓖麻體內(nèi)Cu濃度，低量磷肥配施氮肥能增加蓖麻根部Cu濃度，高量磷肥配施氮肥使蓖麻葉部Cu濃度減少，這可能是施肥增大蓖麻根、莖生物量引起的稀釋效應(yīng)。

蓖麻積累Cu的變化如表4所示。單施氮肥時，銅積累量隨施氮量增加而減少；單施磷肥時，銅積累量隨施磷量增加先減少后增加。當施磷量為0、80、200 mg/kg 時，低氮 (N75) 處理的銅積累量高于其他氮濃度處理且差異顯著，其中N75P200處理蓖麻銅積累量最高，是N0P0處理的2.33倍，N75P0、N75P80處理銅積累量是N0P0處理的2.04、1.93倍，并與N75P200差異顯著。銅積累量隨氮肥用量增加而減少；單施磷肥和低氮 (N75) 配施磷肥處理銅積累量隨施磷量增加而增加，中氮高氮 (N150、N300) 配施磷肥處理銅積累量隨施磷量增加而減少。添加氮、磷肥后，銅在蓖麻各器官的分布仍為根＞葉＞莖，但轉(zhuǎn)運系數(shù) (地上部銅積累量/地下部積累量) 變化很大，變化規(guī)律與銅積累量變化規(guī)律相反，N300P20處理最低，N300P0處理最高。

2.3 施肥對土壤pH值和不同形態(tài)銅含量的影響

土壤pH值的變化見表5。施肥但未種植蓖麻土壤pH值范圍8.28～8.45，除N0P200、N75P200處理外，其余處理的pH值均低于N0P0處理。單施氮肥，土壤pH值與N0P0相比顯著降低但不同濃度間無差異；施磷量為20 mg/kg的處理之間土壤pH值無顯著差異；施氮量為0、75、300 mg/kg時，高磷處理土壤pH值都顯著高于其他處理。種植蓖麻土壤pH值范圍8.09～8.26，其變化規(guī)律與未種植蓖麻土壤的相似，施磷量為20、200 mg/kg的處理之間土壤pH值無顯著差異，氮、磷肥配施除N150P20處理外土壤pH值都高于N0P0處理。種植蓖麻土壤pH比未種植土壤低0.2～0.4個單位。

表2 不同施肥處理下蓖麻干重 (g/plant)Table2 Dry weight of castor under different fertilization

土壤Cu形態(tài)變化的BCR分級結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，所有土壤中可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Cu之和都超過總量的60%，未種植蓖麻處理之間、種植蓖麻處理之間不同形態(tài)Cu所占比例無顯著變化。施肥但未種植蓖麻土壤中弱酸提取態(tài)Cu平均含量為3.54 mg/kg，占全量的0.3%，種植蓖麻土壤中弱酸提取態(tài)Cu平均含量為12.11 mg/kg，占全量的1.0%，提升了3.58倍；種植蓖麻土壤中可還原態(tài)Cu比例較未種植土壤增加約10%，殘渣態(tài)Cu占比減少約10%，可氧化態(tài)Cu比例基本不變。可見，種植蓖麻可能會導(dǎo)致殘渣態(tài)Cu向可還原態(tài)Cu轉(zhuǎn)化。

3 討論

3.1 氮、磷肥施用對蓖麻生長的影響

植物的光合作用需要Cu參與，但Cu過量會從三方面抑制光合作用：1) 破壞類囊體的結(jié)構(gòu)功能，抑制初級電子供體和受體產(chǎn)生；2) 增加葉綠體酶活性，加快葉綠素分解；3) 與葉綠素的巰基結(jié)合，替代Mg2+、Zn2+、Fe2+，改變?nèi)~綠素蛋白中心離子，導(dǎo)致葉綠素失活[2]。本試驗除P20配施氮肥、N75配施磷肥處理蓖麻葉片SPAD值含量不因施肥量而變化，其余都隨施肥量增加而增加，可能因為養(yǎng)分施用不平衡對蓖麻生理過程造成影響，養(yǎng)分配比會間接影響蓖麻對其他養(yǎng)分的吸收[22]，進而影響葉綠素合成。

表3 不同施肥處理下蓖麻體內(nèi)銅含量 (mg/kg)Table3 Cu contents of castor under different fertilization

根干重隨施肥量增加先增加后減少，可能是植物缺乏養(yǎng)分時，根系為獲取養(yǎng)分而不斷生長，但當土壤養(yǎng)分充足時，根系不需要太長就能獲得足夠的養(yǎng)分，所以在高施肥量時根干重減少，這是一種適應(yīng)性的變化。蓖麻總干重隨施氮量增加而減少，隨施磷量增加而增加，低氮和高磷更利于蓖麻正常生長，可能是環(huán)境中Cu脅迫導(dǎo)致蓖麻不能正常吸收養(yǎng)分，施氮過多反而加重脅迫。

3.2 氮、磷肥施用對蓖麻體內(nèi)銅含量的影響

植物吸收重金屬的量是土壤重金屬種類、形態(tài)、含量，肥料種類、施用量，以及植物本身積累重金屬能力的綜合體現(xiàn)，所以施肥對植物吸收積累重金屬的作用效果不一致[23]。施用硝態(tài)氮肥可增加水稻對鎘的吸收[24]，施用尿素和磷酸二氫銨可增加印度芥菜和蓖麻對Cd的積累[25]；相反地，F(xiàn)ang等[26]發(fā)現(xiàn)，施用重過磷酸鈣可降低大白菜對Cu的吸收，高超等[27]施用磷酸鈣和磷酸二銨抑制了水稻對Pb的吸收，因為營養(yǎng)狀況改善可提高水稻抵抗重金屬的能力，減少其對重金屬的吸收。

本試驗結(jié)果表明，施用磷肥既可增加蓖麻的生物量，又可增加蓖麻根、莖中銅的濃度?？赡茉蛴校?) 供試蓖麻屬于耐性植物，對銅富集能力強[28]；2) 磷酸鹽可與鐵生成磷酸鐵沉淀，降低土壤中鐵的生物有效性[29]，缺鐵情況下鐵通道蛋白 (IRT1) 及相關(guān)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運蛋白大量表達，這些蛋白也可運輸銅離子，提高植物對銅的吸收[30]；3) 銅過量時，植物體內(nèi)大量活性氧自由基產(chǎn)生，造成脂質(zhì)過氧化，施用磷肥可促進非酶抗氧化保護劑產(chǎn)生，增大抗氧化酶類的活性[31]，減少植物體內(nèi)活性氧自由基，增加植物的抗性。

表4 氮、磷配施對蓖麻積累銅的影響Table4 Effects of N and P fertilizers on Cu accumulation in castor

蓖麻體內(nèi)銅積累量與轉(zhuǎn)運系數(shù)變化相反，銅積累量越高轉(zhuǎn)運系數(shù)越低，意味著根系是蓖麻主要的解毒場所。種植蓖麻兩個月積累銅的平均值達到19.87 μg/株，最高達到 34.93 μg/株，與典型的銅超積累植物海州香薷相比具有修復(fù)潛力[32–33]。

3.3 氮、磷肥施用對土壤pH值和銅形態(tài)的影響

施用化肥會對土壤pH值和其它性質(zhì)帶來明顯影響。土壤pH是影響土壤重金屬形態(tài)最重要的因素，對重金屬在土壤中的行為變化起主要作用[34]。NH4NO3對土壤酸化貢獻較大，NH4+經(jīng)硝化作用可在短期內(nèi)顯著降低土壤pH值，NO–3通過淋溶作用帶走鹽基離子，可使土壤進一步酸化，長期施用硝酸銨會導(dǎo)致土壤pH值下降[35–36]。NaH2PO4是強堿弱酸鹽，H2PO4

表5 不同施肥處理下土壤pH值Table5 Soil pH under different fertilization

–交換解吸土壤膠體上的OH–會引起土壤pH值升高，起到鈍化銅的作用[37]。本試驗中，施肥處理的土壤pH值下降。蓖麻根系在受到重金屬脅迫后，會分泌更多的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等[10]，引起根系土壤pH降低，本試驗中蓖麻根系發(fā)達，種植盆中的土壤被蓖麻根系完全包裹，是土壤pH下降的主要原因，也可能是殘渣態(tài)銅向氧化態(tài)銅轉(zhuǎn)變的原因之一。

4 結(jié)論

圖1 土壤不同形態(tài)銅含量百分比Fig.1 Percentages of the different forms of Cu in soil

氮、磷肥施用能有效提高蓖麻葉片SPAD值和植株生物量，增加Cu在蓖麻體內(nèi)的積累，N75P200處理的蓖麻銅積累量在供試處理中最高。施用磷肥對蓖麻吸收積累Cu的促進效果高于施用氮肥。種植蓖麻可有效增加土壤Cu的有效性，對Cu形態(tài)的影響比施加氮、磷肥對土壤中Cu形態(tài)的影響大。本試驗是植物修復(fù)和化學修復(fù)，這兩種土壤重金屬污染原位修復(fù)方法的聯(lián)合，在實際應(yīng)用中需要確定具體的施肥比例，進一步弄清促進蓖麻吸收積累銅的機制。