何萬領(lǐng),李曉麗*,常會慶,楊肖娥
(1 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,河南洛陽 471023;2 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南洛陽 471023;3 環(huán)境修復(fù)與生態(tài)健康教育部重點實驗室/浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,杭州 310029)
砷 (As) 是廣泛存在于自然界中的一種類金屬元素。砷被認(rèn)為是一種環(huán)境毒物,長期的砷暴露會引起各種健康效應(yīng)[1–2]。但低劑量的砷對動物生長、繁殖具有促進(jìn)作用,被認(rèn)為是動物體必需的微量元素之一[3]。1964年美國最早允許有機砷制劑應(yīng)用于雞飼料中,1983年正式批準(zhǔn)用作豬和雞的促生長劑。阿散酸 (Asanilic acid,又名對氨苯胂酸) 作為砷制劑的一種,能夠殺死腸道有害菌、控制動物腹瀉、提高動物機體免疫力、改善飼料養(yǎng)分利用率和促進(jìn)動物生長[4]。自1996年我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)作為動物飼料添加劑以來,阿散酸在畜牧養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用。然而,阿散酸作為飼料添加劑在動物消化道內(nèi)吸收較少,僅為10%~20%,大部分以原形隨糞便排入
環(huán)境[5],繼而通過動物糞肥和灌溉的途徑進(jìn)入土壤。阿散酸在動物飼料中添加量一般為100 mg/kg左右[6],而隨動物糞便排出的阿散酸量將被3~10倍濃縮[7],因此,長期施用或一次大量施入含阿散酸動物糞便的情況下極易造成高濃度阿散酸的污染。Garbarino等[8]對美國馬里蘭州長期施用雞場廢棄物的土壤樣品檢測發(fā)現(xiàn),砷含量達(dá)10~50 mg/kg,相當(dāng)于阿散酸28~145 mg/kg。本實驗室對使用有機砷制劑的綜合養(yǎng)殖區(qū)周圍土樣調(diào)查發(fā)現(xiàn),排污口土壤、糞便堆積區(qū)和周圍菜地中阿散酸含量可達(dá)32~129 mg/kg (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。據(jù)推測,若按照當(dāng)前阿散酸添加量,一個萬頭豬場每年向環(huán)境中排放的阿散酸及其代謝物約200 kg,16年后土壤含砷量可增加1倍[9]。進(jìn)入土壤中的阿散酸可進(jìn)一步降解為無機態(tài)砷,但此過程由于受阿散酸暴露濃度、時間、土壤性質(zhì)等的影響,所需時間達(dá)幾天到幾十天甚至幾個月。因此,研究阿散酸污染對作物的影響及砷向作物體內(nèi)的遷移特點是十分必要的,但目前該部分研究較少,難以闡明畜牧養(yǎng)殖過程中砷制劑污染的環(huán)境效應(yīng)及作用機制。為此,本文通過模擬阿散酸暴露試驗研究阿散酸對水稻生長發(fā)育及砷積累的影響,為進(jìn)一步研究阿散酸污染在食物鏈中的環(huán)境過程與機制提供實驗依據(jù)。
供試土壤樣品采自河南科技大學(xué)試驗?zāi)翀?34°6′30′′N、112°0′10′′E) 表層土,土壤類型為褐土,土壤基本理化性質(zhì)為:pH 7.52、有機質(zhì) 21.58 g/kg、陽離子交換量 16.73 cmol/kg、總氮 1.09 g/kg、有效磷 37.14 mg/kg、速效鉀 82.36 mg/kg、總砷14.21 mg/kg。
準(zhǔn)確稱取一定量飼料級阿散酸 (阿散酸含量35%) 溶于55~60℃水中,制成不同阿散酸濃度的水溶液,將阿散酸水溶液分別均勻噴灑于3份動物糞便上 (確保動物在飼養(yǎng)過程中不使用任何含砷制劑),邊噴灑邊混合,并用少量超純水反復(fù)清洗噴壺3次,清洗液同樣均勻噴灑于糞便中,將糞便置于70℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干,碾碎,過2 mm篩,以不加阿散酸糞便為空白對照。
取0—20 cm土層農(nóng)田土,除去土樣中根系、樹葉、雜物等,同時將大塊土破碎,自然風(fēng)干,再用木槌碾碎,過2 mm篩。按照每公頃22000 kg施用量將烘干的動物糞便與供試土混勻,從而制成含阿散酸為 30 mg/kg、75 mg/kg 和 150 mg/kg 的試驗用土樣。
采用盆栽試驗,在15 L的塑料盆中盛10 kg風(fēng)干的土壤。按照每公頃施用氮肥 (純 N) 160 kg、鉀肥(K2O) 240 kg、磷肥 (P2O5) 120 kg 的添加量,將三種肥料供體尿素、碳酸氫鉀、磷酸二氫鈉均勻拌入各土壤中,然后裝盆。
所用水稻品種為徐稻3號,種子經(jīng)過精選后育苗,于5葉期選擇大小一至的稻苗移栽,移栽前土壤先淹水兩天。按每盆3穴、每穴3株移栽,栽培管理參照水稻大田管理措施。每處理設(shè)6次重復(fù),處理間隨機排列。水稻種植當(dāng)天,各處理取土樣,分析其中阿散酸和總砷含量 (表1)。
植株樣品采集分別在水稻分蘗期、開花期、成熟期進(jìn)行,分蘗期和開花期樣品分為根、莖、葉,成熟期樣品分為根、莖、葉、稻殼和糙米。除籽粒之外的所有植株樣品都先用自來水沖洗,再用蒸餾水清洗,所有樣品 (籽粒除外) 在105℃下殺青30 min,之后在70℃下烘干至恒重,稱重后用不銹鋼磨樣機 (DFT-50,大德中藥機械有限公司,中國溫嶺) 進(jìn)行粉碎備用;籽粒用糙米機 (JLGJ-45,臺州市振國糧用器材廠,中國臺州) 出糙,用瑪瑙磨樣機(MM301,Retsch 公司,德國) 粉碎。
表1 水稻種植當(dāng)天各處理土樣中阿散酸與總砷含量(mg/kg,DM)Table1 Total concentration of arsanilic acid(AA)and arsenic in soil samples of each group on the day of rice planting
土壤中阿散酸的提取與檢測參考郭瑞子等[10]報道的方法。準(zhǔn)確稱取干燥后的土樣1.0000 g于15 mL離心管中,加入3 mL甲醇–乙腈混合液,混勻后,于8000 r/min離心10 min,獲得上清液,40℃氮氣吹干,用1 mL流動相溶解,加0.2 mL二氯甲烷混勻,于 12000 r/min 離心 10 min,過 0.22 μm 微孔濾膜。用高效液相色譜 (Waters-2695,美國Waters公司)法測定濾液中的阿散酸含量。流動相為40 mmol/L磷酸二氫鉀溶液–甲醇 (96∶4,V/V),超聲波內(nèi)脫氣20 min,流速為 1.0 mL/min,進(jìn)樣體積 10 μL,檢測波長244 nm,柱溫為室溫。
分別準(zhǔn)確稱取土樣、根樣 0.1000 g,其他植株樣品各0.5000 g于三角瓶中,加入20 mL濃硝酸、2.5 mL濃硫酸和1.25 mL高氯酸,加蓋放置過夜。次日置電熱板上160℃~170℃消解,至冒白煙時取出冷卻,再加入5 mL去離子水蒸發(fā)至冒白煙,將余酸趕盡,冷卻。用去離子水將消化液洗入50 mL容量瓶中,加10 mL 5% (W/V) 硫脲 + 抗壞血酸混合液,以 5% (V/V) HCl定容。用雙道原子熒光光度儀 (AFS-9130,北京吉天儀器有限公司,中國北京) 測定消煮液中As含量。
采用SPSS13.0中的ONE-WAY ANOVA模塊進(jìn)行統(tǒng)計分析,均值的多重比較采用Duncans方法進(jìn)行,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示。作圖采用Sigmaplot 13.0軟件進(jìn)行。
從表1結(jié)果可知,對照土樣中總砷含量為14.21 mg/kg,低于翁煥新等[11]報道的我國土壤背景值的上限15 mg/kg,可以作為對照土樣用于砷污染試驗;隨著阿散酸添加量的增加,土樣中總砷含量不斷增加,其增加幅度與阿散酸增加幅度具有較好的相關(guān)性,說明各處理土樣除受本試驗阿散酸暴露外,沒有受其他砷源污染的影響;由阿散酸實測值分析可知,在水稻栽培當(dāng)天,各處理土樣中阿散酸均有不同程度的降解,且阿散酸含量越低,降解率越高。
由圖1結(jié)果可知,與對照組相比,各阿散酸水平對水稻根系長度、單株根數(shù)及株高影響不顯著 (P >0.05);150 mg/kg阿散酸的無效分蘗顯著高于對照和30 和 75 mg/kg 阿散酸處理 (P<0.05);隨著阿散酸污染水平增加,水稻產(chǎn)量呈降低趨勢,150 mg/kg阿散酸水稻產(chǎn)量顯著低于其他各處理 (P<0.05),75 mg/kg阿散酸顯著低于對照 (P<0.05),但與 30 mg/kg 阿散酸無顯著差異 (P > 0.05)。
由表2結(jié)果可知,與對照相比,除30 mg/kg阿散酸處理成熟期水稻莖中砷含量無顯著差異 (P >0.05) 外,其他各阿散酸處理分蘗期、開花期和成熟期根、莖和葉中砷含量均顯著增加 (P<0.05)。75 mg/kg阿散酸水稻分蘗期根中砷含量顯著高于30 mg/kg阿散酸,而分蘗期莖、葉中砷含量及開花期和成熟期根、莖、葉中砷含量這兩個濃度間無顯著差異 (P > 0.05);與 75 mg/kg 阿散酸相比,150 mg/kg阿散酸各時期水稻各部位砷含量增加不顯著 (P >0.05),但與 30 mg/kg 阿散酸相比,150 mg/kg 阿散酸分蘗期根及開花期與成熟期根、莖和葉中砷含量顯著增加 (P<0.05)。
圖1 不同水平阿散酸對水稻生長發(fā)育的影響Fig.1 Effects of different levels of arsanilic acid on rice growth development[注(Note):方柱上不同字母表示處理間差異顯著 (P<0.05)Different letters above the bars indicate significantly different among treatments (P<0.05).]
表2 不同水平阿散酸對不同時期水稻各部位砷含量的影響 (mg/kg,DM)Table2 Effects of different levels of arsanilic acid(AA) on arsenic content in different parts of rice at different growth stages
圖2 水稻不同生育期根、莖和葉中砷含量Fig.2 Arsenic content in root, stem and leaf of rice at different growth stages
由圖2結(jié)果可知,隨著生育期進(jìn)展,水稻根系中砷含量增加,在開花期時達(dá)到最高,成熟期呈減少趨勢,且不同程度低于分蘗期。水稻莖中砷含量隨生育期進(jìn)展而增加,其中對照、30 mg/kg和75 mg/kg阿散酸處理時,莖中砷含量在開花期達(dá)到最高,成熟期減少,對照和30 mg/kg阿散酸成熟期莖中砷含量低于分蘗期;阿散酸處理水平為150 mg/kg時,水稻莖中砷含量表現(xiàn)為成熟期 > 開花期 > 分蘗期。隨著水稻生育期的推移,葉中砷含量呈增加趨勢,在阿散酸處理水平為30和75 mg/kg時,水稻葉中砷含量在開花期達(dá)到最高,成熟期呈減少趨勢,其中對照和30 mg/kg阿散酸成熟期葉中砷含量低于分蘗期;阿散酸處理水平為150 mg/kg時,水稻葉中砷含量表現(xiàn)為成熟期 > 開花期 > 分蘗期。
由表3結(jié)果可知,與對照相比,阿散酸各處理水稻穎殼、米糠、糙米和精米中砷含量顯著增加 (P< 0.05),隨著阿散酸濃度增加,籽粒各部位砷含量呈增加趨勢,與30 mg/kg阿散酸處理相比,75 mg/kg處理米糠和糙米中砷含量顯著增加 (P<0.05),150 mg/kg處理穎殼、米糠、糙米和精米中砷含量均顯著增加 (P<0.05)。
砷積累量分析表明 (圖3),對照單株砷積累量糙米大于穎殼,阿散酸暴露使穎殼砷積累量不同程度大于糙米;與對照相比,阿散酸各處理穎殼和糙米中砷積累量均顯著增加 (P<0.05);隨著阿散酸濃度增加,穎殼和糙米中砷積累量均以 75 mg/kg阿散酸處理最大,其中穎殼砷積累量顯著高于150 mg/kg阿散酸處理 (P<0.05),糙米砷積累量顯著高于 30 mg/kg(P<0.05) 和 150 mg/kg (P<0.05) 阿散酸處理。與對照相比,隨阿散酸濃度增加穎殼和糙米中砷積累量分別增加9.11、9.42、6.53倍和2.11、3.71、2.57倍。
隨著畜牧養(yǎng)殖過程中有機砷污染加劇,有機砷對農(nóng)作物的影響受到廣泛關(guān)注。但目前的一些研究多集中于洛克沙胂[12–15],關(guān)于阿散酸暴露對作物生長發(fā)育的影響只有Wang等[16]進(jìn)行過相關(guān)研究工作,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)按照砷濃度為10~50 mg/kg的梯度直接將阿散酸施入土壤后,阿散酸能夠顯著降低水稻株高、有效分蘗數(shù)、稻草產(chǎn)量和千粒重,并與砷處理濃度呈明顯負(fù)相關(guān)。與其研究結(jié)果并不完全相同,本試驗通過盆栽研究含阿散酸糞肥對水稻生長發(fā)育的影響,表明30~150 mg/kg水平阿散酸對水稻根系長度、單株根數(shù)和株高并無不良影響,但當(dāng)阿散酸污染水平為75 mg/kg及以上時水稻無效分蘗增加,水稻產(chǎn)量顯著降低。這一結(jié)果可能與阿散酸的加入方式不同有關(guān),從而使得阿散酸在土壤中的降解效率和形態(tài)不同,對水稻的危害也不同。劉利軍等[17]研究認(rèn)為,有機砷制劑對植物體基本上是無毒的,但其在土壤中可降解為有毒產(chǎn)物,降解快慢和產(chǎn)物種類與多種因素相關(guān),其中土壤有機質(zhì)是主要因素之一。有機質(zhì)能夠促進(jìn)阿散酸在其上的吸附作用,從而使阿散酸降解緩慢[18–19]。蔣成愛等[20]研究表明,有機質(zhì)不但自身能牢固吸附阿散酸,而且其分解后形成的有機酸等產(chǎn)物可通過降低土壤pH的方式促進(jìn)鐵氧化物對阿散酸的吸附作用。奚功芳[21]對有機砷制劑洛克沙胂的研究表明,隨著有機肥用量從1000 mg/kg增加到10000 mg/kg,洛克沙胂降解緩慢,低有機質(zhì)組在處理第15天即完成降解過程,而高有機質(zhì)組在45天時仍有超過50%的洛克沙胂未被降解,且這一過程與洛克沙胂處理濃度呈負(fù)相關(guān)。這是因為高濃度有機砷制劑能夠抑制土壤微生物活動,從而降低有機砷處理前期微生物的降解效率[15]。就本試驗而言,30 mg/kg阿散酸組雖降解較快,但其含砷量為8.4 mg/kg,有效態(tài)砷 (能夠?qū)λ井a(chǎn)生毒害的砷量)含量較低,不會對水稻產(chǎn)生明顯的毒性作用[22]。當(dāng)阿散酸含量在75 mg/kg及以上時,由于受動物糞肥及高濃度阿散酸抑制微生物活動的共同影響,降解緩慢,在水稻根系分化、株高生長的前期有效態(tài)砷含量低于毒性閾值。隨著生長期推進(jìn),阿散酸分解增加,土壤有效態(tài)砷含量達(dá)到毒性閾值。研究表明,高濃度無機砷能夠阻礙作物水分從根部向地上部的輸送,從而難以滿足灌漿期籽粒生長的需要[23],此外,高濃度砷能夠降低葉片葉綠素含量,使作物光合作用降低,造成營養(yǎng)不良,生長發(fā)育畸形[24–25]。通過比較穗部畸形水稻和正常水稻中砷含量發(fā)現(xiàn),穗部畸形水稻穗中砷含量顯著高于正常水稻中砷含量[26–27]。曹瑩等[28]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)土壤砷處理濃度為40 mg/kg時,對水稻生長發(fā)育有顯著抑制,砷濃度為60 mg/kg是水稻穗部畸形發(fā)生的臨界水平。這可能是本試驗150 mg/kg 阿散酸處理 (實測砷濃度為 62.06 mg/kg)水稻無效分蘗 (植株綠色、直立、穎殼畸形、不揚花結(jié)實等) 顯著升高的主要原因。
表3 不同水平阿散酸對穎殼、米糠、糙米和精米中砷含量的影響 (mg/kg,DM)Table3 Effects of different arsanilic acid (AA) levels on arsenic content in rice husk, rice bran, brown rice and polished rice
圖3 不同阿散酸水平對穎殼和糙米砷積累量的影響Fig.3 Effects of different arsanilic acid levels on the As accumulation of brown rice and husk[注(Note):柱上不同字母表示相同植株部位處理間差異顯著 (P <0.05) Different letters above bars mean significant difference among treatments for the same plant part (P<0.05).]
在相同生育期內(nèi),含阿散酸糞肥處理水稻各部位砷含量顯著高于對照組,各部位砷積累量依次為根系 > 葉 > 莖 > 穎殼 > 籽粒。這與早期對無機砷污染的研究結(jié)果一致[29],也符合水稻器官砷積累的一般規(guī)律。研究表明,水稻根系存在的鐵膜是砷在根際富集的主要原因,并同時固定砷、有效減少其向水稻地上部的轉(zhuǎn)運[30]。隨著阿散酸濃度增加,分蘗期、開花期和成熟期水稻各部位砷積累表現(xiàn)出相似的趨勢,且不同生長時期水稻各部位砷積累量存在不同,這與早期研究結(jié)果一致[14]。對整個生育期水稻各部位砷積累分析發(fā)現(xiàn),在阿散酸水平為0~75 mg/kg時,水稻根、莖、葉具有相似的積累特性,即隨著生長期各部位砷積累逐漸增加,在開花期達(dá)到最高,成熟期呈下降趨勢,這也與早期的研究結(jié)果相似[14,31];然而,本試驗 150 mg/kg阿散酸水平各部位砷積累特性并不完全相同,表現(xiàn)為根部隨生長期推移與0~75 mg/kg水平具有相似的特點,莖葉中砷含量隨生長期積累增加,并在成熟期積累量最大。這一結(jié)果可能與阿散酸的降解率及有效砷水平有關(guān),30 mg/kg和75 mg/kg阿散酸降解較快且有效砷未達(dá)到使地上部畸形發(fā)育的劑量,水稻在正常的吸收和轉(zhuǎn)運機制下完成砷的積累,并符合一般積累規(guī)律,即生育旺盛期富砷能力強,生育后期由于根系鐵膜老化以及地上部砷的損失等導(dǎo)致砷含量呈下降趨勢[32–33]。相反,150 mg/kg組地上部無效分蘗 (植株綠色、直立、穎殼畸形、不揚花結(jié)實等) 多,莖葉砷損失量少,且向籽粒中轉(zhuǎn)運少,從而導(dǎo)致莖葉中具有較高的砷積累量。
砷向水稻籽粒遷移的多少關(guān)系到人類的食物安全問題。早期研究已證實,水稻籽粒砷含量與土壤砷濃度有關(guān),并因水稻品種不同而異[34–36]。一些調(diào)查發(fā)現(xiàn)[37],近些年隨著環(huán)境砷污染加重,各地區(qū)或國家稻米中砷含量呈不同程度的升高趨勢,污染嚴(yán)重區(qū)水稻籽粒砷含量可達(dá)0.5~7.5 mg/kg。安晨昕等[38]研究表明,隨著灌溉水中砷濃度增加,稻米籽粒中砷含量不斷增加,當(dāng)灌溉水中砷濃度由0.09 mg/kg增加到0.14 mg/kg和0.27 mg/kg時,精米中砷含量顯著增加。陳成[25]研究表明,與10 mg/kg砷含量組相比,當(dāng)土壤中砷含量為35 mg/kg和53 mg/kg時,水稻籽粒中砷含量極顯著增加,53 mg/kg組籽粒砷含量較35 mg/kg組顯著增加。與以上研究結(jié)果相似,本試驗中隨著土壤阿散酸污染水平增加,水稻穎殼、米糠、糙米和精米中砷含量均呈增加趨勢,與30 mg/kg阿散酸組相比,75 mg/kg組米糠和糙米中砷含量顯著增加,150 mg/kg組水稻籽粒各部位砷含量均顯著增加。穎殼和糙米中砷積累量分析表明,隨著阿散酸暴露水平的增加,砷積累量呈增加趨勢,并在75 mg/kg時達(dá)到最大,150 mg/kg時降低,這一結(jié)果可能與150 mg/kg阿散酸組水稻籽粒產(chǎn)量顯著低于75 mg/kg組有關(guān),從而使得單株水稻穎殼和糙米中砷積累量顯著降低。隨著阿散酸水平增加,水稻穎殼和糙米砷積累較對照組分別增加9.11、9.42、6.53倍和2.11、3.71、2.57倍,這表明,土壤阿散酸污染對稻米可食部砷積累存在潛在安全風(fēng)險。
以上可知,通過本盆栽模擬試驗?zāi)軌蚝芎玫胤从嘲⑸⑺嵛廴緦λ旧L發(fā)育及砷積累的影響,初步揭示出阿散酸暴露對水稻生長發(fā)育及砷積累的影響與暴露濃度及暴露時間密切相關(guān),即暴露濃度越大,時間越長越不利于水稻的生長發(fā)育,且水稻植株各部位砷積累量呈增加趨勢。但本試驗尚存在一些問題:1) 與傳統(tǒng)的糞肥施用方法存在一定差距。一般情況下動物糞肥在熟化后施用,這一過程可能更有利于阿散酸的降解,且其降解產(chǎn)物的種類和毒性作用與在土壤中的降解作用不同,相應(yīng)的對水稻的毒害作用也不同;2) 就本試驗結(jié)果而言,75 mg/kg阿散酸水平已對水稻稻穗分化和稻米產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響,而30~75 mg/kg的阿散酸梯度是否產(chǎn)生不利影響有待進(jìn)一步研究;3) 在農(nóng)藝措施與水稻生長相互作用下,阿散酸在土壤中的降解規(guī)律尚不清楚,有待進(jìn)一步的研究工作。
在0~150 mg/kg污染水平,阿散酸對水稻根長、單株根數(shù)及株高無不利影響,隨著污染水平增加,阿散酸能夠顯著影響水稻稻穗分化和稻米產(chǎn)量,75~150 mg/kg阿散酸污染水平使水稻稻米產(chǎn)量減少25%~45%。因此,長期大量施用含阿散酸糞肥勢必造成我國主要糧食作物的減產(chǎn)。
從砷積累來看,水稻各部位砷積累隨阿散酸污染水平增加而增加,其分布規(guī)律與無機砷污染相似,即根積累量最多,依次為葉和莖;阿散酸污染能夠增加水稻可食部砷安全風(fēng)險,阿散酸水平為75~150 mg/kg時,稻米可食部砷積累增加2.11~3.71倍,糙米砷含量達(dá)1.04~1.19 mg/kg,精米砷含量達(dá)0.21~0.27 mg/kg,均超過了我國稻米砷限量標(biāo)準(zhǔn)0.2 mg/kg(GB2762-2012)。
總之,在以褐土為試驗土壤、施用含阿散酸非堆漚糞肥每公頃22000 kg的情況下,土壤阿散酸水平為75 mg/kg及以上時即對水稻品種徐稻3號產(chǎn)生不利影響,并造成稻米可食部砷積累風(fēng)險。因此,建議在上述土壤類型、糞肥處理方式與用量,甚至作物品種相同的情況下,施用阿散酸污染的糞肥時,應(yīng)檢測阿散酸含量,確保施用后土壤阿散酸含量不超過 75 mg/kg。