徐勝威,斯烈鋼,申屠基康,楊 程,沈偉良
(寧波市海洋與漁業(yè)研究院,浙江寧波 315141)
目前進(jìn)出口海產(chǎn)品的安全問題備受人們關(guān)注,藥物的殘留問題也成為重點檢測的對象。在生產(chǎn)實踐中,不僅要關(guān)注用藥后水產(chǎn)動物代謝物對水產(chǎn)品安全隱患,更需重視抗菌漁藥難降解問題,全方位地控制藥物殘留的問題,確保在加強治療的同時做到生態(tài)環(huán)境不遭到不必要的破壞。因此根據(jù)抗菌漁藥特性及藥代動力學(xué)特征來制定一系列合理、科學(xué)的用藥措施顯得尤為重要。
諾氟沙星是一種廣泛用于水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的抗菌藥,屬于第三類喹諾酮類藥物。其抑菌機理是通過作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶,干擾DNA的復(fù)制而產(chǎn)生抑菌作用。作為一種抑菌效果較好的水產(chǎn)藥物諾氟沙星在水產(chǎn)領(lǐng)域使用較廣泛,在草魚 Ctenopharyngodon idellus[2]、中華鱉Trionyx Sinensis[3]、日本鰻鱺Anguilla japonica[4]、斑節(jié)對蝦Penaeus monodon[5]等多種水產(chǎn)動物中均有報道。
近年來,由于凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei的高密度集約化養(yǎng)殖而引起的各類細(xì)菌性病害頻發(fā)。諾氟沙星藥物對細(xì)菌性疫病療效普遍較好[5],但此類抗生素的使用安全性越來越引起重視。農(nóng)業(yè)部2292號公告中明文禁止了在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑。自2015年12月31日起,停止生產(chǎn)洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑,涉及的相關(guān)企業(yè)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號同時注銷,2016年12月31日后禁止流通使用。因此開展南美白對蝦諾氟沙星藥物殘留具有現(xiàn)實意義。目前,藥物殘留檢測方法主要有高效液相色譜法和一些商品化的快速檢測試劑盒。但能否在正確時間段有效檢測到殘留藥物并估算出用藥量需要有相應(yīng)的基礎(chǔ)性研究。凡納濱對蝦細(xì)菌性病害通常發(fā)病于高溫季節(jié),結(jié)合休藥期的長短可估算出最佳采樣期。目前,國內(nèi)尚未見關(guān)于諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)藥代動力學(xué)、組織分布與消除規(guī)律的報道。由于用藥濃度、用藥時間、魚體規(guī)格及養(yǎng)殖方式的不同諾氟沙星在魚蝦體內(nèi)代謝規(guī)律會有較大差異。本實驗根據(jù)我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中實際用藥濃度和用藥時間研究了養(yǎng)殖模式下諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的藥代動力學(xué)、組織分布與消除規(guī)律。為諾氟沙星在凡納濱對蝦中的代謝規(guī)律提供了理論數(shù)據(jù),并為加強該藥物的管理和監(jiān)督非法使用提供理論依據(jù)。
實驗選用健康無疾病的凡納濱對蝦(平均體長 6.0±0.5 cm,平均體重 1.43±0.21 g)。
實驗用凡納濱對蝦在鹽度為 25,水溫為 28.0±1.0 ℃,pH8.2±0.3 條件下在 1 m3玻璃鋼桶中暫養(yǎng)兩周,氨氮和亞硝酸鹽控制在0.05 mg/L以下,暫養(yǎng)期間投喂不含藥物的對蝦飼料,實驗開始前48 h進(jìn)行饑餓處理。
副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus為從患有急性肝胰腺壞死病的凡納濱對蝦中分離。
水產(chǎn)常用喹諾酮類藥物(純度>98%,見表1);諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度≧98.0%),乙腈為色譜純,鹽酸、無水硫酸鈉和四丁基溴化銨為分析純;高效液相色譜儀(美國Waters 2695),離心機(美國熱電17R),振蕩儀(IKA MS 3 digital)等。
采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)和稀釋法測定幾種常見喹若酮類藥物對副溶血性弧菌的抑菌效果,篩選出效果最好的一種藥物,并確定抑菌濃度。
根據(jù)《新編漁藥手冊》的藥物劑量說明,進(jìn)行了預(yù)實驗,確定諾氟沙星與飼料(粉料)按質(zhì)量比為1:1 000制成顆粒飼料較為合理,控制每顆飼料重約2 mg。將實驗蝦放于長35 cm寬25 cm的八格塑料盒中,每格放1尾,設(shè)立實驗組(投喂藥餌)和對照組(投喂不含藥物餌料)。實驗開始時每尾蝦投喂10顆飼料,分別在投喂后 0.5、1、2、4、6、8、16、24、48、96 h 等時間段取樣,連續(xù)跟蹤 18 d。每次取樣時,對照組和實驗組各取3尾蝦,每尾蝦取血淋巴、肝胰腺和肌肉樣品稱重并于-80℃保存,用于后續(xù)的藥物含量測定。每次取樣時統(tǒng)計飼料剩余量,并在1 h后將剩余藥餌全部撈出,改喂不含藥物的常規(guī)飼料。
1.7.1 血淋巴
向血樣中加入200 μL酸化乙腈(乙腈:50%鹽酸=2 500:20),渦旋混合,加入800 μL流動相,混勻離心后過微孔濾膜,裝高效液相色譜儀專用瓶中,濾液供高效液相色譜儀測定。
1.7.2 肝胰腺和肌肉樣品
向肝胰腺和肌肉樣品中加入1mL酸化乙腈,加少量無水硫酸鈉,渦旋振蕩至充分混勻,離心3min,取上清液至10mL玻璃試管中,再向樣品中加入1mL酸化乙腈,重復(fù)上述操作1次,將兩次收集的上清液混合。置于氮吹儀中氮吹至所收集上清液蒸干,向玻璃試管中加入1mL流動相,混合均勻,過微孔濾膜,裝高效液相色譜儀專用瓶中,濾液供高效液相色譜儀測定。
色譜柱 C18柱 (150 mm×4.6 mm);乙腈:四丁基溴化銨溶液=5:95(V/V);柱溫:40 ℃;流速:1.5mL/min;激發(fā)波長:280 nm;發(fā)射波長:450 nm,進(jìn)樣量 20 μL。
取對照組的血樣加10 μg/ml的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL,空白組的肝胰腺和肌肉組織各加10 μg/mL和1 μg/mL諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL,每組做3個平行,每個濃度重復(fù)3次測定回收率,回收率=實測藥物濃度/理論藥物濃度×100%。
用Origin75軟件做出標(biāo)準(zhǔn)曲線和藥時曲線,用DAS2.0軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合和參數(shù)計算。
副溶血性弧菌6種喹若酮類藥物的藥敏試驗結(jié)果見表1,藥敏紙片結(jié)果:副溶血性弧菌對諾氟沙星最敏感,其次為吡哌酸和鹽酸諾氟沙星。根據(jù)抑菌圈的大小初步篩選出抑菌效果最好為諾氟沙星和吡哌酸,最小抑制濃度(MIC)實驗結(jié)果顯示諾氟沙星MIC為0.781 mg/L,吡哌酸MIC為1.563 mg/L。綜合藥敏試驗結(jié)果,對副溶血性弧菌抑菌效果最好為諾氟沙星。為進(jìn)一步研究諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的代謝過程,采用高效液相色譜法測定諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的藥代動力學(xué)。
表1 藥敏試驗結(jié)果Tab.1 Results of drug sensitivity test
回收率測定結(jié)果見表2。血淋巴的藥物回收率最高為87.7%,肝胰腺和肌肉組織平均回收率依次為64.15%和63.65%。
表2 諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的回收率Tab.2 The recoveries of norfloxacin in L.vannamei
諾氟沙星在凡納濱對蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的分布半衰期(T1/2α)依次為1.047、1.204、1.951 h;消除半衰期(T1/2β)依次為 69.315、14.812、69.315 h;吸收半衰期(T1/2Ka)依次為 0.704、0.954、1.832 h;達(dá)峰時間(Tmax)依次為 1、4、4 h;達(dá)峰濃度(Cmax)依次為 13.527 5、1.904 4、698.916 7 mg/L;藥時曲線下面積(AUC)依次為6.764、9.538、7 013.467 mg·h-1·L-1(表3)。
血淋巴的藥時曲線在0.5~48 h內(nèi)整體處于下降趨勢,且在0.5~1 h內(nèi)急劇下降,8 h后藥物濃度接近于零;肌肉和肝胰腺的藥時曲線變化趨勢基本一致,在0.5~1 h內(nèi)急劇下降,1~4 h緩慢上升并于4 h后開始下降;肝胰腺中下降較為緩慢,在14 d時仍檢測到微量諾氟沙星,于16 d后下降為零,而肌肉組織于8 h后降為零,這與血淋巴表現(xiàn)一致(圖1~3)。
喹諾酮類抗生素因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點,被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中。諾氟沙星是氟喹諾酮類藥物之一,該類藥物吸收較快,藥物進(jìn)入體內(nèi)后大多在2 h內(nèi)達(dá)到血藥濃度最大值,且AUC值較大,生物利用度高,藥效好[6]。本研究通過藥敏試驗,在6種喹諾酮藥物的篩選中發(fā)現(xiàn)引起凡納濱對蝦弧菌性疾病的副溶血性弧菌對諾氟沙星最為敏感。李小義等[7]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論:從患病的凡納濱對蝦肝胰腺中分離出副溶血性弧菌,通過抗生素試驗,發(fā)現(xiàn)該菌株對包括諾氟沙星在內(nèi)的多種抗生素敏感。諾氟沙星通過作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶,干擾DNA的復(fù)制達(dá)到抑菌效果,廣泛用于水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的抗菌藥,對細(xì)菌出血性敗血病的敏感度較高,利用該藥在生產(chǎn)應(yīng)用中效果良好[8]。
表3 諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of norfloxacin in L.vannamei
圖1 血淋巴的藥時曲線Fig.1 The norfloxacin concentrationtime curve of hemolymph
圖2 肌肉的藥時曲線Fig.2 The norfloxacin concentrationtime curve of muscle
圖3 肝胰腺的藥時曲線Fig.3 The norfloxacin concentrationtime curve of hepatopancreas
藥代動力學(xué)中的 T1/2α、T1/2β、Tmax和 Cmax等是衡量藥物在體內(nèi)吸收速度和程度的重要參數(shù)。本實驗中,諾氟沙星在血淋巴、肝胰腺、肌肉中的 T1/2α依次為 1.047、1.951、1.204 h,T1/2Ka依次為 0.704、1.832、0.954 h,T1/2β依次為69.315、69.315、14.812 h,表明諾氟沙星在血淋巴中吸收較快,其次是肌肉,在肝胰腺中吸收相對較慢,而在血淋巴和肝胰腺中殘留時間較肌肉的長。房文紅等[5]在斑節(jié)對蝦藥代研究中發(fā)現(xiàn),通過一次性肌肉注射諾氟沙星溶液,當(dāng)藥物劑量為10 mg/kg時,T1/2α和 T1/2β分別為0.0635 h和0.612 h,這與本實驗中的T1/2α和T1/2β的差異較大,此結(jié)果可能和給藥方式與物種差異有關(guān)。青蝦Macrobrachium nipponense在一次性肌肉注射25 mg/kg諾氟沙星后,血淋巴和肌肉 T1/2α依次為1.66 h和0.08 h,T1/2β為1.69 h和4.42 h,T1/2Ka為 1.66 h 和 0.08 h,Tmax為 1.82 h 和 0.03 h,Cmax為 6.008 mg/L 和 16.72 mg/L[9]。說明在青蝦中肌肉對諾氟沙星的吸收較血淋巴快,且在肌肉中殘留時間也較血淋巴長,這與肌肉注射的給藥方式有關(guān)。本實驗中諾氟沙星在凡納濱對蝦血淋巴、肝胰腺和肌肉組織Tmax依次為1、4、4 h,結(jié)合藥時曲線,三者均在0.5~1 h內(nèi)急劇下降,血淋巴的藥時曲線在0.5~48 h內(nèi)整體呈下降趨勢,且在8 h后藥物濃度接近于零,而肝胰腺和肌肉的藥時曲線均在1~4 h緩慢上升并于4 h后開始下降。肝胰腺中下降較為緩慢,在16 d后藥物殘留才降為零,而肌肉組織于8 h后降為零,這可能是由于蝦進(jìn)食后藥物最先進(jìn)入血淋巴,而后進(jìn)入肝胰腺和肌肉有關(guān)。血淋巴的藥時曲線整體呈現(xiàn)下降趨勢且在8 h后藥物接近于零,肝胰腺和肌肉的藥時曲線在1~4 h又出現(xiàn)一個上升的階段,這是藥物在組織中滯后于血淋巴并且與累積效應(yīng)有關(guān);肝胰腺在較長時間內(nèi)仍能檢測到一定量的諾氟沙星,這與肝臟作為解毒器官,對藥物的蓄積有一定的關(guān)系。房文紅等[10]研究在兩種給藥方式下諾氟沙星在凡納濱對蝦血淋巴中的藥代動力學(xué),發(fā)現(xiàn)肌肉注射藥物和藥餌口服給藥條件下,前者藥物濃度表現(xiàn)為迅速上升,給藥后2min達(dá)到最高值,之后下降速度較快,而后者給藥后諾氟沙星濃度迅速上升至4 h達(dá)到最高,隨后下降又回升在12 h出現(xiàn)第二個藥峰,這與本實驗諾氟沙星在肝胰腺和肌肉的藥時曲線趨勢基本一致,均在4 h出現(xiàn)峰值,這相當(dāng)于一次“自體給藥”過程。關(guān)于藥物吸收出現(xiàn)雙峰或多峰現(xiàn)象的研究在其他動物已有研究[11],本實驗主要目的為研究諾氟沙星在凡納濱對蝦體內(nèi)的代謝消除時間,同時,為保證蝦有一定的攝食時間,故在0.5 h內(nèi)沒有設(shè)置取樣點,因此曲線無法呈現(xiàn)兩個完整峰。在實際藥殘檢測中,結(jié)合本實驗諾氟沙星在凡納濱對蝦血淋巴、肝胰腺和肌肉的藥代動力學(xué)參數(shù)和藥時曲線,投喂過諾氟沙星的凡納濱對蝦至少應(yīng)經(jīng)過448℃.d后藥物才會消除。