維C不同補(bǔ)充時間對運(yùn)動小鼠血細(xì)胞DNA氧化損傷的影響

蘇美華，許慶忠，張水蓮

(閩南師范大學(xué)體育學(xué)院,福建漳州 363000)

運(yùn)動性氧應(yīng)激引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是造成細(xì)胞DNA損傷的機(jī)制之一[1-3]。補(bǔ)充抗氧化劑來預(yù)防或緩解DNA損傷已經(jīng)得到實驗證實[2-3]。維生素C(VC)具有良好的抗氧化作用，可以清除體內(nèi)過量的自由基，預(yù)防氧應(yīng)激對機(jī)體的DNA損傷，保護(hù)細(xì)胞的正常功能[4-6]。但目前有關(guān)大強(qiáng)度運(yùn)動下VC補(bǔ)充時間及效應(yīng)還尚缺乏研究報道。本文采用彗星實驗[3]對力竭運(yùn)動導(dǎo)致的外周血細(xì)胞DNA損傷情況進(jìn)行檢測，通過運(yùn)動前兩小時和運(yùn)動后兩小時補(bǔ)充維生素C觀察其對血細(xì)胞DNA損傷和自由基的影響，為健身人群在劇烈運(yùn)動環(huán)境下如何選擇補(bǔ)充維生素C的時間提供數(shù)據(jù)參考，從而采用更為有效的方法和手段來預(yù)防和消除運(yùn)動疲勞所產(chǎn)生的副作用。

1 實驗材料與方法

1.1 動物分組與VC的補(bǔ)充

實驗動物采用7～8周昆明純系健康清潔級雄性小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買)，體重29.42±1.89g，置于清潔消毒動物房，室內(nèi)溫度20±3℃，相對濕度50±5.5%，分籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照晝夜比12h∶12h。小鼠隨機(jī)分為對照組(CG)、運(yùn)動組(EG)和運(yùn)動前兩小時補(bǔ)充VC組(VCG+E)以及運(yùn)動后兩小時補(bǔ)充VC組(E+VCG),共4組，每組各8只，共32只。對照組采用正常飼養(yǎng)，VCG+E和E+VCG分別在每天運(yùn)動前和運(yùn)動后2小時補(bǔ)充VC(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)，劑量為每天150mg/kg體重，劑量濃度10mg/mL[6],連續(xù)補(bǔ)充6天。對照組每天灌胃0.40mL生理鹽水。

1.2 力竭運(yùn)動動物模型的建立

力竭運(yùn)動模型根據(jù)Marra[7]報道建立。各組小鼠休息3天后，第4天各運(yùn)動組采用跑臺適應(yīng)性練習(xí)3天，適應(yīng)跑速從10m/min至28m/min。再休息2天，第8天開始正式訓(xùn)練，坡度0°，速度10m/min，10min內(nèi)逐漸調(diào)節(jié)跑速至28m/min，以此跑速持續(xù)運(yùn)動至力竭。各組每天上午10∶00訓(xùn)練，持續(xù)6天。力竭標(biāo)準(zhǔn)：隨著運(yùn)動時間的延長，動物不再堅持原跑速，跟不上跑臺速度，滯于跑道后1/3處達(dá)3次以上，采用任何刺激驅(qū)趕無效，跑完后體征為腹臥位，神情倦怠，呼吸急促，對刺激反應(yīng)遲鈍[1-2]。

1.3 采血與單細(xì)胞懸液制備

各運(yùn)動組分別在最后一天訓(xùn)練至力竭即刻眼眶取血2滴(約2mL)置于加有200μl枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管內(nèi)，置于4℃冰箱待測。顯微鏡下用預(yù)冷的PBS將各血樣的100μl血液調(diào)整成含2×104個/mL的細(xì)胞懸液。

1.4 彗星實驗流程

實驗方法根據(jù)Mastaloudis[3]報道稍加改進(jìn)。每只血樣制作2張載玻片，制好的載玻片置于水平電泳槽中，將新配置的堿性電泳緩沖液倒入電泳槽，約覆過膠面0.25cm左右，放置20min，使DNA雙螺旋解旋。解旋后，電泳槽設(shè)置為25V、250mA的條件，電泳30min。停止電泳后，小心將玻片取出放入中和緩沖液中和15min。取出玻片，滴加濃度5μg/mL的EB染液30～50μL到膠體表面，蓋上蓋玻片，染色15～20min后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 抗氧化酶SOD、GSH活性與MDA水平的測定

各組血樣離心后，取血漿測試。采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活力；采用比色定量法檢測細(xì)胞還原型谷胱甘肽(GSH)的濃度；采用硫代巴比妥酸比色法(TBA法)來測定過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，并按說明書操作。

1.6 統(tǒng)計分析

熒光顯微鏡調(diào)至515～560nm的激發(fā)光模塊，在200×下，隨機(jī)觀察每張載玻片上的5個視野，每個視野5個細(xì)胞以上。采用IMI1.0彗星分析軟件(深圳良正軟件開發(fā)有限公司)測定尾慣量、Olive尾矩、分布矩等指標(biāo)[3]，運(yùn)用統(tǒng)計軟件EXCEL2010和SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，均值間的多重比較采用Duncan’s法檢測，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠血細(xì)胞DNA損傷的彗星圖

熒光顯微鏡下觀察染色片發(fā)現(xiàn)，CG的絕大部分血細(xì)胞無顯著拖尾現(xiàn)象，邊緣光滑，熒光強(qiáng)度均勻，即圓圓的彗星頭部(圖1-A)；EG的多數(shù)血細(xì)胞彗星頭部直徑減小，“彗星”尾部逐漸變長變大，尾部的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，拖尾的彗星樣細(xì)胞明顯增多(圖1-B)；而VCG+E血細(xì)胞仍接近圓形熒光圖，但部分細(xì)胞彗星頭部略有縮小(圖1-C)，E+VCG小鼠也有部分細(xì)胞出現(xiàn)“彗星尾”，但拖尾現(xiàn)象看起來不是很明顯(圖1-D)。

2.2 各組小鼠血細(xì)胞DNA損傷的彗星軟件分析

采用彗星軟件分析各組小鼠血細(xì)胞的DNA損傷形態(tài)圖。通過分析發(fā)現(xiàn)(表1)，EG小鼠血細(xì)胞尾慣量、Olive尾矩和彗星分布矩顯著高于CG(P<0.001)，VCG+E和E+VCG組這三個指標(biāo)則顯著低于EG，而VCG+E低于E+VCG(P<0.05)。

表1 各組小鼠血細(xì)胞DNA彗星指標(biāo)

注：與CG比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與EG比，#P<0.05,###P<0.001。

2.3 小鼠血漿中SOD活性、GSH和MDA含量的檢測

各組血漿SOD活性、GSH濃度和MDA的含量檢測結(jié)果見表2。從表2可知，EG血漿SOD活性、GSH和MDA含量顯著高于CG(P<0.001)，VCG+E和E+VCG小鼠血漿中SOD活性和MDA含量都顯著低于EG，且VCG+E低于E+VCG(P<0.05)。

表2 力竭運(yùn)動后小鼠血漿中SOD活性、GSH和MDA含量

注：與CG比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001；與EG比，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001。

3 討論

DNA極易遭到外源性毒性物質(zhì)以及內(nèi)源性代謝氧化產(chǎn)物等因素的損害，從而產(chǎn)生DNA鏈斷裂、糖基或堿基損傷以致細(xì)胞突變或死亡，進(jìn)而誘發(fā)癌變[8]。大強(qiáng)度運(yùn)動時所產(chǎn)生自由基是機(jī)體安靜時的20倍以上，可對機(jī)體的心肌、血細(xì)胞、淋巴等細(xì)胞DNA產(chǎn)生顯著的損傷效應(yīng)[1-3]，本實驗也發(fā)現(xiàn)6天的大強(qiáng)度運(yùn)動可對小鼠血細(xì)胞DNA產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷作用并導(dǎo)致小鼠血漿SOD活性、GSH和MDA含量顯著升高，表明大強(qiáng)度運(yùn)動所致的血細(xì)胞DNA損傷與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系。

維生素C被認(rèn)為是抗氧化營養(yǎng)素，能夠直接與脂氧自由基或脂過氧自由基反應(yīng)，使脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中斷而起到抗氧化的作用[4-5]。有研究證實氧化應(yīng)激增強(qiáng)可誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高，當(dāng)細(xì)胞受到一個可容忍濃度的氧自由基作用后，細(xì)胞就能通過激活抗氧化酶活性產(chǎn)生抗高濃度自由基的能力[6-7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充VC小鼠在大強(qiáng)度運(yùn)動后，血漿SOD活性、MDA含量均顯著低于EG，說明補(bǔ)充VC使機(jī)體受到的氧化應(yīng)激水平顯著低于不補(bǔ)充組，提示維生素C具有抗氧化能力，能參與清除機(jī)體所產(chǎn)生的自由基，有效地抑制了大強(qiáng)度運(yùn)動所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激；另一方面VC還能促進(jìn)和調(diào)動抗氧化酶系，激活抗氧化能力，阻斷某些誘變因素，抵抗外界因素如大強(qiáng)度運(yùn)動所誘發(fā)的大量自由基攻擊，從而保護(hù)DNA免受過氧化脂質(zhì)損傷[8-9]。大強(qiáng)度運(yùn)動所導(dǎo)致的血細(xì)胞DNA損傷與運(yùn)動性氧應(yīng)激有關(guān)，而維生素C還是一種水溶性抗氧化劑和自由基修復(fù)劑[9-10]，可同體內(nèi)重要的酶類抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱苷肽酶(GSH)等構(gòu)成體內(nèi)抗氧化損傷的第一道重要防線，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基的氧化損傷，從而抑制和減少DNA鏈的斷裂，使細(xì)胞DNA損傷水平降低[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動前兩小時補(bǔ)充VC的DNA損傷值顯著低于運(yùn)動后兩小時補(bǔ)充VC，提示運(yùn)動前補(bǔ)充VC增加了機(jī)體抗氧化能力儲備，減緩了運(yùn)動后自由基對細(xì)胞DNA的損傷作用，從而提高了VC的保護(hù)效應(yīng)。

4 結(jié)論

大強(qiáng)度運(yùn)動可通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)小鼠血細(xì)胞的DNA損傷，運(yùn)動前2小時補(bǔ)充VC較運(yùn)動后補(bǔ)充VC更能有效抑制運(yùn)動性氧應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化效應(yīng)，緩解大強(qiáng)度運(yùn)動所致的細(xì)胞DNA損傷。