田飛焱 歐陽敏 謝世紅 王龍 徐節(jié)華 劉文珍 花麒 孟霞 銀旭紅 劉彬

(1. 江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西南昌 330046；2. 彭澤縣水產(chǎn)局，江西九江，332700)

0 引言

鯽魚作為江西省食用魚的主要品種之一，2016年江西省鯽魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)21.21萬噸，產(chǎn)量穩(wěn)步持續(xù)增長。目前，江西省養(yǎng)殖的優(yōu)良品種鯽魚包括：彭澤鯽魚、萍鄉(xiāng)肉紅鯽魚、異育銀鯽魚等，它們不僅有良好的食用價值，有些還有很好的觀賞價值。然而，近年來，在江蘇等省一種新的嚴(yán)重危害養(yǎng)殖鯽魚的鰓出血性疾病開始悄然發(fā)生與傳播，該病的致死率最高可達(dá)90%～100%，給這些省造成了嚴(yán)重的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，后經(jīng)證實該鰓出血性疾病的病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型[(cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2[1-3]，疾病名稱確定為鯽魚造血器官壞死病，也有稱為金魚造血器官壞死病(Goldfish Haematopoietic necrosis， GFHN)]、異育銀鯽“鰓出血病”或金魚皰疹病毒性造血器官壞死病。該病主要發(fā)生在春秋季節(jié)，受水溫影響較大，15℃～25℃易發(fā)病，水溫高于25℃發(fā)病率下降[4，5]。目前，CyHV-2在內(nèi)陸池塘養(yǎng)殖的鯽中有呈明顯的蔓延趨勢，因此調(diào)查江西省養(yǎng)殖區(qū)域是否存在CyHV-2分布顯得尤為緊迫。為了調(diào)查了解CyHV-2在江西省鯽魚養(yǎng)殖區(qū)域的傳入與分布情況，保障江西省鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，本研究于2015～2017年應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction， PCR)和實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR， qPCR)方法對全省范圍內(nèi)一些重要苗種場和養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖鯽魚進(jìn)行CyHV-2監(jiān)測，并比較了不同地區(qū)CyHV-2分離株的分子特征，旨在摸清本地區(qū)鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)流行本底情況，提高疫病風(fēng)險預(yù)警防控能力，避免發(fā)生區(qū)域性重大疫情。

1 材料與方法

1.1 采樣

鯽魚樣品：2015～2017年組織全省縣級水生動物防疫站在全省范圍內(nèi)抽檢水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場，每個水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場每年只抽檢一個批次樣品，三年共抽檢80批體表檢查均無明顯病癥的樣品[根據(jù)某一魚類養(yǎng)殖群體(≥100000尾)假定病原2%感染率，確定每批采集樣品數(shù)≥150尾]，并依據(jù)流行病學(xué)情況填寫現(xiàn)場采樣記錄，由省水產(chǎn)技術(shù)推廣站水生動物疫病監(jiān)控中心進(jìn)行鯽魚造血器官壞死病原檢測；部分臨床疑似病例在鯽魚造血器官壞死病發(fā)病高峰期間由省內(nèi)漁民送檢，由省水產(chǎn)技術(shù)推廣站水生動物疫病監(jiān)控中心進(jìn)行病原檢測。

1.2 樣品處理

取鯽魚體內(nèi)臟(一般為腎、脾、肝)或鰓置于研磨器中，加入10倍體積的無菌PBS研磨，反復(fù)凍融2～3次，待勻漿后將全部勻漿液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中，10000離心2分，取100μL上清液于1.5mL EP管中。

1.3 DNA抽提

取已處理的樣品100μL，按照天根生物科技有限公司的血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(DP304)試劑盒或Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit說明書的方法提取總DNA，作為PCR擴(kuò)增模板。

1.4 PCR檢測

使用TaKaRa PCR Amplification Kit進(jìn)行PCR檢測，采用兩對特異引物(如表1所示)分別擴(kuò)增 CyHV-2 的DNA聚合酶基因和解旋酶基因中的片段。反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(Mg2+) 5μl，dNTPs (含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmoL/L) 1μl，引物CyHVpol-F(或CyHV2Hel-F)(10μM) 1μl，引物CyHVpol-R(或CyHV2Hel-R)(10μM) 1μl，DNA 模板2.5μl，Taq酶(5U/μL，TaKaRa) 0.5μl，純水補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)程序為：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃(CyHV引物)或60℃(CyHV-2引物)1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸 10min，最后4℃保溫。

表1 CyHV-2 普通PCR 2對引物序列

1.5 熒光PCR復(fù)檢

對普通PCR擴(kuò)增條帶不明顯的監(jiān)測或病例樣品采用熒光PCR進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增檢測(如表2所示)。在PCR管中依次加入：2×預(yù)混合液(2×supermix)6.25μL、正向和反向引物各0.5μL、探針0.5μL、模板2.5μL、加水定容至12.5μL。瞬時離心，將反應(yīng)管置于熒光PCR儀。反應(yīng)程序為：95℃ 2分；95℃ 30秒、58℃ 45秒、72℃ 45秒，共40個循環(huán)；在每次循環(huán)72℃退火延伸時收集熒光，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

表2 CyHV-2 熒光PCR引物和探針序列

1.6 序列分析

所有PCR電泳呈陽性的樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序后用DNAStar以及NCBI BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列同源性分析，從GenBank中選取與陽性序列相似的參考毒株，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測

利用CyHV/CyHV-2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，陽性對照會出現(xiàn)362 bp/366 bp的特異性條帶，陰性對照和空白對照均沒有該條帶，待測樣品擴(kuò)增出362 bp/366 bp的條帶，初步判定待測樣品pol/Hel PCR陽性，未擴(kuò)增出目的條帶得判定為pol/Hel PCR陰性。同時滿足以上兩條的可判定為CyHV-2陽性(如圖1所示)。

圖1 CyHV-2 PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 熒光PCR檢測

對PCR擴(kuò)增條帶不明顯的監(jiān)測樣品，采用熒光PCR進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增檢測，Ct值≤35且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判定為熒光PCR陽性(如圖2所示)；對于35

圖2 CyHV-2熒光PCR擴(kuò)增圖譜

2.3 監(jiān)測結(jié)果

如表3所示，2015～2017年在江西9個地級市的22個區(qū)(縣、市)的水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場采集并檢測樣品80批次，監(jiān)測品種包括鯽和金魚，共監(jiān)測到CyHV-2陽性樣品6個批次，總的陽性檢出率為 7.5%。陽性樣品來源的地級市包括江西省鯽主養(yǎng)區(qū)南昌市、鷹潭市、吉安市和觀賞紅鯽養(yǎng)殖區(qū)萍鄉(xiāng)市。陽性樣品分布區(qū)域較為分散，贛東、贛中、贛西、贛南均有陽性檢出，在地理上是分散的，并不連接成片，相互間沒有水源相通。

表3 2015～2017年江西地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖(苗種)場CyHV-2監(jiān)測情況

2.4 流行特征

時間分布：2015～2017年在江西地區(qū)春季檢測樣品32個，陽性5個，陽性檢出率15.6%；秋季檢測樣品48個，陽性1個，陽性檢出率0.02%。統(tǒng)計分析與2檢驗表明春、秋兩季的CyHV-2的陽性檢出率沒有差別(P>0.1)，即季節(jié)對CyHV-2的陽性檢出率無顯著性影響。

遺傳進(jìn)化樹和同源性分析：所有PCR電泳呈陽性的樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序后與GenBank中的參考序列進(jìn)行NCBI BLAST同源性比對，相似度均在99%以上，確定為CyHV-2陽性?；?015～2017年CyHV-2監(jiān)測數(shù)據(jù)，進(jìn)行CyHV-2 DNA解旋酶基因部分序列同源性的系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示江西省監(jiān)測的所有CyHV-2毒株與YC110907、SY-C1、JS2012、H.Fukuda等CyHV-2病毒株屬同一分支，與KHV-I、KHV-U等CyHV-3病毒株的親緣關(guān)系較近，而與CyHV-1的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(如圖3所示)。

圖3 基于CyHV-2 DNA解旋酶基因部分序列同源性的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

20世紀(jì)90年代，在日本西部養(yǎng)殖的金魚發(fā)生皰疹病毒性造血器官壞死病大流行，死亡率幾乎達(dá)到了100%，這是有關(guān)該病的首次報道[4]。隨后，美國養(yǎng)殖的金魚幼魚也發(fā)生此病，并存在著廣泛的病原分布，造成的死亡率通常高達(dá)80%以上[5，6]。觀賞魚的國際貿(mào)易很大程度上促進(jìn)了該病的迅速傳播[7]，在這之后其他國家或地區(qū)相繼有該疾病暴發(fā)的報道[8-11]，2011年在匈牙利養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了CyHV-2感染的病例[12]，在我國鯽造血器官壞死病在2012年之前還未見有爆發(fā)流行的文獻(xiàn)報道[13]，2013年李莉娟等針對國內(nèi)市場上流通的金魚開展CyHV-2的流行病學(xué)調(diào)查，表明不同區(qū)域的金魚攜帶CyHV-2的帶毒率為13.89%，表明我國已有CyHV-2的分布[14]。最近幾年隨著該病原的傳入給我國一些地區(qū)的鯽養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

已有研究表明，CyHV-2存在垂直傳播的特性[15]，潛伏感染也是皰疹病毒的主要特征之一[16]，因此，一旦親魚攜帶病毒，就能通過魚卵傳播給子代，導(dǎo)致病原進(jìn)一步擴(kuò)大傳播，苗種是漁業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，健康優(yōu)質(zhì)的苗種需要從源頭上切斷疾病的傳播。鑒于全國范圍內(nèi)苗種和觀賞魚的流通使該病原傳入我省的風(fēng)險極大，必須通過病原監(jiān)測來掌握該病病原傳入與分布情況來提高我省疫病風(fēng)險預(yù)警防控能力，避免發(fā)生區(qū)域性重大疫情。目前，江西省養(yǎng)殖的良種鯽包括：彭澤鯽、萍鄉(xiāng)肉紅鯽、異育銀鯽、湘云鯽等品種，其中彭澤鯽是江西省選育出的優(yōu)良品種，是“鄱陽湖”注冊商標(biāo)的重要養(yǎng)殖對象，并已逐步形成了我省的彭澤鯽產(chǎn)業(yè)集群；萍鄉(xiāng)肉紅鯽更是當(dāng)?shù)氐陌倌晏禺a(chǎn)，不僅有良好的食用價值，而且還很有觀賞價值。連續(xù)三年(2015～2017年)監(jiān)測的數(shù)據(jù)顯示，80批次樣品檢出的6例陽性樣本，累積平均陽性檢出率為7.5%，6批陽性樣品分別來自3家省級原良種場和3家成魚養(yǎng)殖場，省級原良種場陽性樣本占總陽性樣本的50%，說明我省鯽養(yǎng)殖業(yè)和觀賞金魚養(yǎng)殖業(yè)存在感染CyHV-2的風(fēng)險，也無疑會給鯽造血器官壞死病在江西省進(jìn)一步擴(kuò)大流行范圍埋下了隱患。在監(jiān)測所覆蓋的9個各地級市中，有4個地級市檢出了陽性樣本，包括江西省鯽主養(yǎng)區(qū)南昌市、鷹潭市、吉安市和觀賞紅鯽養(yǎng)殖區(qū)萍鄉(xiāng)市。陽性樣本分布區(qū)域較為分散，贛東、贛中、贛西、贛南均有陽性檢出，說明在江西省鯽造血器官壞死病存在擴(kuò)大流行區(qū)域的特征。鑒于當(dāng)前鯽造血器官壞死病病原陽性檢出率和分布尚未成擴(kuò)散的趨勢，因此需要在鯽苗種的主要產(chǎn)區(qū)應(yīng)進(jìn)行苗種檢驗檢疫，杜絕從陽性養(yǎng)殖場輸出攜帶病毒的苗種，從源頭上切斷病毒的擴(kuò)散途徑，防控CyHV-2的傳播，筑牢產(chǎn)業(yè)生物安全屏障。