李彥　呂純莉　肖代敏

【中圖分類號】R734.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】2095-6851（2018）06--01

CIK細(xì)胞又稱自然殺傷樣T淋巴細(xì)胞，是新一代過繼性免疫治療的首選方案，具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、毒性小、對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，是目前發(fā)現(xiàn)的殺瘤活性最強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞之一。目前認(rèn)為，CD3+CD56和CD3+CD8+表型T淋巴細(xì)胞是CIK群體中的主要效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮著重要的抗腫瘤作用。參芪扶正注射液是中藥類新藥，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[3]。本研究利用參芪扶正注射液的特性，將其添加于臨床應(yīng)用的CIK培養(yǎng)體系，探討中藥聯(lián)合CIK抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制，旨在為CIK細(xì)胞培養(yǎng)尋找更優(yōu)化的路徑和方法。

一材料與方法

1.材料與試劑

收集癌癥病人全血25ml；淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）：天津太平洋科技有限公司；參芪扶正注射液：麗珠集團(tuán)利民制藥廠；抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC、CD56-FITC 抗體：美國Becton Dickinson公司。

2.方法與步驟

2.1 CIK細(xì)胞的制備

取腫瘤患者的外周血25ml，按2：1的比例用PBS稀釋血液，再加等體積的淋巴細(xì)胞分離液，2000rpm離心20min，小心吸取白膜層于50ml離心管中，加入PBS，1200 rpm離心5 min，棄上清，用含有10%胎牛血清的GT-T551培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為1000U/ml的IFN-γ，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 小時(shí)后加入濃度為50 ng/ml的CD3單抗和300 U/ml 的IL-2，每3 天換液同時(shí)補(bǔ)充300 U/ml IL-2。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為三組，分別是對照組、50μl參芪組、100μl參芪組。對照組按CIK細(xì)胞制備方法培養(yǎng)；50μl參芪組和100μl參芪組按CIK細(xì)胞制備方法培養(yǎng)的同時(shí)分別加入50μL/ml和100μL/ml參芪扶正注射液。

2.3 CIK細(xì)胞增殖測定

在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天和第12天分別取各組培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮液，用臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)CIK細(xì)胞，并除以第0天的初始細(xì)胞數(shù)，得出實(shí)際的增殖倍數(shù)。

2.4 細(xì)胞表型分析測定

分別收集誘導(dǎo)培養(yǎng)前單個(gè)核細(xì)胞懸液和誘導(dǎo)培養(yǎng)12天的各組CIK細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為2.0×106/ml以上，用PBS 1000 rpm離心洗滌一次，棄掉上清，分別加入抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC、CD56-FITC、抗體及其同型對照，用流式細(xì)胞儀檢測分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。

二.結(jié)果

1、CIK細(xì)胞增殖倍數(shù)。對照組、50μl參芪組、100μl參芪組的細(xì)胞增殖倍數(shù)均隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，12天達(dá)到最高。由表1可知，參芪組及對照組在第6天、第12天上的細(xì)胞增殖倍數(shù)均高于第0天時(shí)，且差異顯著。和對照組比，50μl參芪組在6天和12天時(shí)間點(diǎn)增殖倍數(shù)為對照組的1.15倍和1.21倍，100μl參芪組增值效應(yīng)為對照組的1.35倍和1.32倍，均比對照組高。

2、細(xì)胞表型分析。與誘導(dǎo)前相比較，對照組和參芪組的CD3+CD4+表達(dá)減少，且差異顯著（P<0.05）；而CD3+、CD3+8+、CD3+CD56+則表達(dá)均有不同程度升高，50μl參芪組能顯著提高CIK細(xì)胞CD3+、CD3+8+的表達(dá)（P<0.05），100μl參芪組則能顯著提高CIK細(xì)胞CD3+、CD3+8+、CD3+CD56+的表達(dá)（P<0.05）

三.討論

本實(shí)驗(yàn)在體外誘導(dǎo)CIK培養(yǎng)后第6天、第12天通過對其計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)因子組和參芪組細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間的增加而增加，100μl參芪組12天時(shí)細(xì)胞增殖245.00±56.86倍，明顯比因子組增殖倍數(shù)多，說明參芪扶正注射液能夠促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖，從而增加了CIK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。CIK細(xì)胞主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+、CD56+T 淋巴細(xì)胞，其可釋放大量具有細(xì)胞毒性的胞漿顆粒對靶細(xì)胞發(fā)揮溶細(xì)胞作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)12天后的CIK細(xì)胞表型進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)12天后的CIK細(xì)胞各組中CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+比誘導(dǎo)前呈現(xiàn)出增高的趨勢，且參芪組比因子組增加更多。說明添加參芪扶正注射液培養(yǎng)的CIK細(xì)胞有利于增強(qiáng)CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，從而提高CIK細(xì)胞的抑瘤作用和殺傷活性。參芪扶正注射液具有提高機(jī)體免疫力，改善機(jī)體抗病能力的作用，而CIK細(xì)胞又具有殺瘤活性高，殺瘤譜廣的特點(diǎn)。將參芪扶正注射液參與刺激誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)，能提高CIK細(xì)胞體外增殖能力和CIK細(xì)胞中CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的百分率，從而提高CIK細(xì)胞的的抗腫瘤效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

秦福麗.PHA 對CIK 細(xì)胞增殖和免疫表型影響的研究[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2004；25（ 5）：421-425.

黃朝暉.人外周血細(xì)胞因子誘導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞的體外高效擴(kuò)增[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2004； 24（ 5） ： 395 - 400.

陸益，陸益線.參芪扶正注射液的藥理作用和臨床應(yīng)用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（10）：2083-2086