郭文淼，辛 宇，，張金堯，汪 洪*

(1.遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

銨態(tài)氮是評(píng)價(jià)水質(zhì)是否受到污染的一個(gè)重要指標(biāo)，銨態(tài)氮在水中存在時(shí)呈游離氨或銨鹽的狀態(tài)，兩者組成主要取決于水的pH值[1]。目前常用水體中銨態(tài)氮的測(cè)量方法有納氏試劑比色法、蒸餾-酸滴定法、水楊酸-次氯酸鹽分光光度法[1]。納氏試劑比色法存在試劑毒性大、干擾因素較多、操作繁瑣復(fù)雜及方法的靈敏度不夠高等缺點(diǎn)。蒸餾-酸滴定法適用于氨氮含量較高的測(cè)定。而且蒸餾需要一定的時(shí)間，測(cè)定的時(shí)間比較長(zhǎng)[1]。水楊酸-次氯酸鹽分光光度法靈敏度較好[2]，環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)HJ 665-2013和HJ 666-2013分別規(guī)范采用連續(xù)流動(dòng)分析儀和流動(dòng)注射結(jié)合水楊酸分光光度法測(cè)定水質(zhì)氨氮[3-4]。靛酚藍(lán)比色法是在高pH值環(huán)境下，將水中的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化成銨鹽的存在形式，測(cè)定水中銨態(tài)氮，水中銨態(tài)氮在強(qiáng)堿性介質(zhì)中與苯酚和次氯酸鈉作用，生成穩(wěn)定的水溶性染料靛酚藍(lán)，吸光度與銨態(tài)氮含量成正比，可在630 nm 處比色測(cè)定[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)(型號(hào)：Varioskan Flash)、連續(xù)流動(dòng)分析儀(型號(hào)：AutoAnalyzer 3)。

1.2 試劑

酚溶液：10.0 g苯酚與0.1 g亞硝基鐵氰化鈉(硝普鈉)溶于1 L水中，放入棕色試劑瓶中于4 ℃儲(chǔ)存。

次氯酸鈉堿性溶液：5 mL次氯酸鈉溶液(10%)和10.0 g檸檬酸三鈉，加水約50 mL，再加入55 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液，用水稀釋至200 mL，每月更換。

緩沖溶液：將40 g檸檬酸鈉溶于約600 mL水中，稀釋至1 000 mL，再加入1 mL十二烷基聚乙二醇醚Brij-35，30%溶液，并混合均勻。每周更換。

水楊酸鈉溶液：將8 g水楊酸鈉溶入約120 mL去離子水中，加入0.2 g硝普鈉，稀釋至200 mL并混合均勻，每周更換。

二氯異氰尿酸鈉溶液：將4 g氫氧化鈉和0.6 g二氯異氰尿酸鈉溶入約120 mL去離子水中，稀釋至200 mL并混合均勻。每周更換。

1 000 mg/L的NH+4-N標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用硫酸銨配制。

所用試劑為分析純，用水為三級(jí)去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

選擇酶標(biāo)儀96孔微孔板：每個(gè)孔中加入130 μL待測(cè)水樣，顯色劑(酚溶液)與反應(yīng)試劑(次氯酸鈉堿性溶液)各加入65 μL。放入30 ℃恒溫箱培養(yǎng)30 min，然后進(jìn)行比色測(cè)定。在200～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸光度，最大吸收波長(zhǎng)確定在630 nm處。6個(gè)水樣顯色穩(wěn)定15、30、60、90、120、150、180 min時(shí)，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，確定顯色穩(wěn)定時(shí)間為30 min。

配制0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mg/L濃度NH+4-N標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述條件測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)NH+4-N溶液濃度之間進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸方程Y=0.476 7X+0.039 9，R2為0.999 5。微孔板孔里不加NH+4-N標(biāo)準(zhǔn)溶液，為試劑空白(空白為質(zhì)量濃度為0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液)實(shí)驗(yàn)。

圖1 酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法的工作曲線

1.4 連續(xù)流動(dòng)分析儀-水楊酸比色方法測(cè)定步驟

參照環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)HJ 665[3]，水樣中銨態(tài)氮與水楊酸鈉和二氯異氰尿酸鈉反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，加入的硝普鈉是作為催化劑，利用連續(xù)流動(dòng)分析儀在660 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)：試樣與試劑在蠕動(dòng)泵的推動(dòng)下進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)模塊，在密閉的管路中連續(xù)流動(dòng)，被氣泡按一定間隔規(guī)律隔開，并按特定的順序和比例混合、反應(yīng)，顯色完全后進(jìn)入流動(dòng)檢測(cè)池進(jìn)行吸光度檢測(cè)。設(shè)置進(jìn)樣速率60個(gè)/h，進(jìn)樣與清洗比為3.0∶1，進(jìn)樣時(shí)間45 s，清洗時(shí)間15 s。儀器默認(rèn)設(shè)置基線和漂移校正，自動(dòng)基線參比為4%；比色濾光片波長(zhǎng)為660 nm，燈強(qiáng)度大于 1 000 mV。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)水樣品重復(fù)測(cè)定6次，6次測(cè)量值Xi的算術(shù)平均值為樣品銨態(tài)氮含量的估計(jì)值，即測(cè)量結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)偏差用貝塞爾公式計(jì)算，即：

連續(xù)流動(dòng)分析儀-水楊酸分光光度法和酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定數(shù)據(jù)間差異顯著性采用Excel軟件中分析工具庫(kù)t-檢驗(yàn)，進(jìn)行成對(duì)雙樣本均值分析。測(cè)定數(shù)據(jù)之間進(jìn)行相關(guān)分析，利用直線方程進(jìn)行回歸，并統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)系數(shù)的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法檢出限

進(jìn)行重復(fù)測(cè)定多個(gè)試劑空白實(shí)驗(yàn)(不加NH+4-N標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他操作程序相同)。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)檢出限測(cè)定方法[8]，檢出限MLD=3×SD，SD為空白測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)方差(圖2)，得到方法檢出限為0.046 mg/L。

圖2 酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定水中銨態(tài)氮的檢出限

2.2 酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定精密度

在相同的測(cè)量條件下，利用酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法對(duì)每個(gè)水樣中銨態(tài)氮含量進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)量，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～2.8%范圍內(nèi)，小于3.0%(表1)。

表1 水樣銨態(tài)氮質(zhì)量濃度的重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.3 酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定準(zhǔn)確度—加標(biāo)回收率

選擇6個(gè)水樣，加入濃度分別為0.50、0.60和0.70 mg/L 的NH+4-N標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照同樣實(shí)驗(yàn)步驟操作，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表2。從表中可見，樣品加標(biāo)回收率在90.7%～101.8%之間。

表2 樣品中銨態(tài)氮加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.4 酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法與連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果比較

圖3列出了酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法和連續(xù)流動(dòng)分析儀-水楊酸分光光度法對(duì)水中銨態(tài)氮的測(cè)定結(jié)果，兩種方法測(cè)定的水中銨態(tài)氮含量范圍分別為0.172～1.307和0.173～1.296 mg/L，平均值分別為0.740和0.735 mg/L，t檢驗(yàn)的雙尾P值小于0.01(表3)，32個(gè)樣品利用兩種方法測(cè)定，結(jié)果彼此間無(wú)顯著差異。

項(xiàng)目酶標(biāo)儀-靛酚藍(lán)比色法連續(xù)流動(dòng)分析儀-水楊酸分光光度法平均0.780.81方差0.070.09樣品數(shù)3232泊松相關(guān)系數(shù)0.976df31P(T≤t)雙尾0.005t雙尾臨界2.040

對(duì)兩種方法測(cè)定銨態(tài)氮含量結(jié)果之間進(jìn)行相關(guān)性分析(圖4)，得到回歸直線方程為Y(連續(xù)流動(dòng)分析儀-NH+4-N)=1.052 4X(酶標(biāo)儀-NH+4-N)-0.009，R2=0.952 7**(n=32，P<0.01)，線性方程斜率為1.052 4，接近1。

圖4 酶標(biāo)儀與連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定水樣銨態(tài)氮質(zhì)量濃度結(jié)果的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

本文采用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)結(jié)合靛酚藍(lán)比色法測(cè)定水中銨態(tài)氮，基于的原理是在堿性條件下，以亞硝基鐵氰化鈉為催化劑，樣品中銨離子與次氯酸鹽和苯酚反應(yīng)生成藍(lán)綠色化合物，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定，該反應(yīng)中一個(gè)重要的條件是混合液顯色適宜pH值維持堿性，約為10.0～13.0左右[5,9]。水體中的金屬離子如鐵、錳、鎂、鈣等，在堿性條件下因產(chǎn)生渾濁干擾測(cè)定[10]。張衛(wèi)宏等[11]報(bào)道了通過(guò)加入掩蔽劑(EDTA 和酒石酸鉀鈉)來(lái)消除干擾，但作者采用流動(dòng)注射分析方法，進(jìn)樣頻率高，管路清洗時(shí)間短，可能導(dǎo)致樣品之間的交叉污染，該文測(cè)定值和加標(biāo)回收率偏高。黃曉[12]采用適當(dāng)降低顯色pH值，使最終pH值控制在10.51～10.57范圍，適用于河口和近海NH+4-N的高精度測(cè)定，準(zhǔn)確度較高。本研究采用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)結(jié)合靛酚藍(lán)比色法測(cè)定水中銨態(tài)氮，比色前，顯色劑與樣品在微孔板里充分混勻，微孔板每孔獨(dú)立，不存在樣品之間交叉污染問(wèn)題，試劑空白值較穩(wěn)定，檢出限為0.046 mg/L。方法的加標(biāo)回收率在90.7%～101.8%之間，與連續(xù)流動(dòng)分析儀-水楊酸分光光度法相比，兩者測(cè)定數(shù)據(jù)之間呈直線線性關(guān)系，回歸直線方程為Y(連續(xù)流動(dòng)分析儀-NH+4-N)=1.052 4X(酶標(biāo)儀-NH+4-N)-0.009，相關(guān)系數(shù)R=0.976 1**(n=32，P<0.01)。方法精密度較高，重復(fù)測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。本文結(jié)論認(rèn)為全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)結(jié)合靛酚藍(lán)比色法測(cè)定重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，快速方便，可用于水樣中銨態(tài)氮含量測(cè)定。