劉彬，王桂英，陸鋆赟

(上海市青浦區(qū)蔬菜技術(shù)推廣站，上海 青浦 201799)

生菜(LactucasativaL.)，又名葉用萵苣，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的綠葉蔬菜之一[1]。上海為我國生菜生產(chǎn)和消費(fèi)最多的地區(qū)之一，2016年種植面積在6 300 hm2左右，近年來上海青浦地區(qū)生菜種植面積一直維持在1 250 hm2。在種植過程中，生菜莖基部腐爛情況發(fā)生較重，發(fā)病后期莖基部分離。春秋冬三季均有發(fā)生，尤以春季發(fā)病最重，其發(fā)病癥狀與軟腐病等不易區(qū)分。為此由請重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所對青浦地區(qū)生菜腐爛病害，進(jìn)行病原菌分離、致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，以明確青浦地區(qū)生菜腐爛的病原，為病原診斷和后期防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2016年12月在青浦區(qū)重固鎮(zhèn)上海春昌蔬果專業(yè)合作社設(shè)施大棚地采集具有典型腐爛癥狀的生菜病株，并收集種植品種種子回實驗室育苗作為陰性對照。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[2]。取典型帶病株，無菌刀片切取病健交界處小塊組織，用1% NaOCl表面消毒5 min，滅菌水沖洗3次，分別置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，每皿3～5塊，置25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)觀察。同時將生菜種子按相同方法處理后觀察培養(yǎng)情況。菌絲萌發(fā)后，選典型菌落轉(zhuǎn)入新皿繼續(xù)培養(yǎng)、純化、保存。

1.3 致病性測定

采用注射法接種分生孢子，用注射器向健康生菜葉片和生菜莖基部注入含有分生孢子的懸浮液(濃度為1.0×106個·mL-1)10 μL，用無菌紗布覆蓋保濕，接種6株，并用無菌水做對照。接種后在氣候箱內(nèi)保持相對濕度90%以上，12 h光照+12 h黑暗25 ℃培養(yǎng)。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在解剖鏡和顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)并測量大小。按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)鑒定[3]。

1.5 病菌ITS序列比較

1.5.1 菌絲體的培養(yǎng)與收集

選取典型菌株SCJH-1601進(jìn)行分子檢測。將斜面保存的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化后的菌株接種到液體PDA培養(yǎng)基，每皿均勻接種2個菌絲塊，每個試管接種2～3個，于25 ℃培養(yǎng)5 d后，用滅菌接種針挑取菌絲，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 基因組DNA 的提取

基因組DNA的提取和純化采用試劑盒方法。

1.5.3 ITS擴(kuò)增

用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。其序列為ITS1：5′-CCGTAGGT GAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′。

1.5.4 PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，反應(yīng)液組分為：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol Mg Cl22 μL，10 mmol dNTP 1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.15 μL，模板DNA 2 μL，引物ITS1和ITS4(25 μmol·L-1)各0.5 μL，dd H2O 16.35 μL，在PTC-100 PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。

擴(kuò)增條件。95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和測序[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離培養(yǎng)結(jié)果

通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，僅發(fā)現(xiàn)1種菌絲，經(jīng)轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該真菌4 d就可在培養(yǎng)基上產(chǎn)生肉眼可見的菌核。該病菌經(jīng)顯微鏡觀察，菌核相對較小，似油菜籽狀，大小0.4～1 mm，子囊孢子橢圓形，大小(12～16)μm×(6～8)μm。通過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離，未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌侵染。

2.2 致病性測定結(jié)果

通過注射法接種分生孢子后，健康生菜莖基部在第3天產(chǎn)生腐爛，并有白色菌絲附著(圖1)，清水對照無任何癥狀；到第7天時，生菜莖基部產(chǎn)生0.5 mm大小的黑色菌核(圖2)，生菜已基本腐爛，輕輕一提就可與根部分離。對第3天和第7天的接種生菜采用1.2方法進(jìn)行分離，得到1種病菌，培養(yǎng)和鏡檢結(jié)果與2.1結(jié)果一致，所以該病菌為青浦地區(qū)生菜腐爛的致病菌。

圖1 致病性測定第3天結(jié)果

圖2 致病性測定第7天結(jié)果

2.3 分子鑒定結(jié)果

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到718 bp序列，經(jīng)Genebank比對，與小菌核菌Sclerotiniaminor比對結(jié)果一致，與KF859921.1相似度達(dá)到100%，

3 小結(jié)與討論

王曉青等[6]研究表明，生菜菌核病病原菌以核盤菌和小菌核菌為主，均屬子囊菌亞門核盤菌科真菌。病菌在發(fā)病后期形成菌核，以休眠體形式長期存活于土壤中。本文的研究結(jié)果與前者基本一致，青浦地區(qū)生菜菌核病致病菌為小菌核菌Sclerotiniaminor為主。通過對病株和種子分離培養(yǎng)，在種子中未發(fā)現(xiàn)該病菌，結(jié)合田間發(fā)生癥狀，該病為土壤中帶菌，不是種子帶菌。

青浦地區(qū)的生菜腐爛由菌核病菌引起，該病主要發(fā)生時期在10月至翌年4月間發(fā)生較重，該時期為油菜菌核病發(fā)生重點(diǎn)時期，青浦地區(qū)油菜多種植在溝渠邊，油菜菌核病和生菜菌核病是否有關(guān)系，后期將結(jié)合生物學(xué)特性和理化分析對該病菌進(jìn)行分析，為后期防治研究提供參考。