李 ，

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是最有價(jià)值的栽培牧草之一，世界各地廣泛種植，根系發(fā)達(dá)，主根粗大，抗逆境和可再生能力較為強(qiáng)大，產(chǎn)草量高，富含蛋白質(zhì)，適口性好，固氮能力強(qiáng)，是我國(guó)人工種植面積最大的豆科牧草[1-2]，在我國(guó)生態(tài)環(huán)境建設(shè)、生態(tài)修復(fù)方面起著重要的作用[3]。

60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于牧草的γ射線輻射誘變育種工作廣泛展開(kāi), 主要集中對(duì)牧草品種對(duì)射線的輻照敏感性、育種的適宜劑量及其輻射誘變規(guī)律的研究[4-6]。植物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能是統(tǒng)一的，功能的差異必然與相應(yīng)的器官結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)[7]。利用60Co-γ射線輻照研究其對(duì)植物顯微結(jié)構(gòu)的影響的研究甚少，如李黎等利用60Co-γ輻射對(duì)兩個(gè)不同品種菊花的葉片組織結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行研究，通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，輻射后植株葉片的柵欄組織的排列比對(duì)照植株排列疏松，柵欄組織細(xì)胞層數(shù)增多[8]。本文研究了60Co-γ輻射苜蓿根莖葉等營(yíng)養(yǎng)器官的生理結(jié)構(gòu)的影響，以期為利用60Co-γ射線輻照選育苜蓿新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為黑龍江省畜牧研究所提供的‘龍牧806’苜蓿干種子，其具有耐寒、耐鹽堿，高產(chǎn)等特性，適合在低溫及鹽堿地上栽種。

1.2 研究方法

1.2.160Co-γ射線輻射處理60Co-γ輻射源由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200，1 500 和1 800 Gy共5個(gè)劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對(duì)照(CK)。

1.2.2幼苗的培養(yǎng) 取5種劑量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射線輻射處理和未輻射的苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在營(yíng)養(yǎng)缽中(針葉土、營(yíng)養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進(jìn)行混合)，1 800 Gy輻射劑量的苜蓿種子雖然能出苗，但在培養(yǎng)期間逐漸死亡，其它輻射劑量和對(duì)照的苜蓿幼苗待生長(zhǎng)至三葉一心期后備用。

1.2.3顯微結(jié)構(gòu)樣品的制備與觀測(cè) 45 d后分別剪取各處理植株根、莖、葉材料，根部為成熟區(qū)的相同部位，莖采集第3葉位的莖段，葉片取第3葉位三出復(fù)葉中間小葉的中部[7]，葉片中部葉脈為中心橫切成大小為5 mm×7 mm的小塊，根、莖切成1 cm長(zhǎng)的小段。立即用福爾馬林-乙酸-乙醇固定液(FAA)固定，1%番紅水溶液染色2 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度為8～12 μm，用0.5%固綠復(fù)染，中性膠封片，于Motic-MODEL-BA300LE顯微鏡下觀察和攝影，每個(gè)處理樣本隨機(jī)取10個(gè)視野求平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%

葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度(SR)=(海綿組織厚度/葉片厚度)×100%

利用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0中單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)植物組織結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射對(duì)苜蓿根顯微結(jié)構(gòu)的影響

苜蓿根的顯微結(jié)構(gòu)包括表皮、皮層、維管柱組成(圖1)。在不同劑量的60Co-γ輻射處理下，苜蓿根的直徑、皮層薄壁細(xì)胞的厚度、表皮的厚度、維管柱的直徑、原生導(dǎo)管及后生導(dǎo)管的直徑均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)輻射劑量為1 500 Gy時(shí)，苜蓿根的厚度、皮層薄壁細(xì)胞的厚度、表皮的厚度，維管柱的直徑、原生導(dǎo)管及后生導(dǎo)管的直徑均達(dá)到最大值。

不同輻射劑量處理下苜蓿根的表皮和皮層厚度、根、導(dǎo)管和維管柱直徑均隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)上升變化趨勢(shì)(表1)，當(dāng)輻射劑量為600和1 500 Gy時(shí)，根表皮的厚度比對(duì)照組增加了34.32%和111.9%，根皮層厚度比對(duì)照組增加了12.27%和39.39%，根直徑比對(duì)照組增加了36.05%和209.87%，根原生導(dǎo)管的直徑比對(duì)照組增加了14.03%和137.19%，后生導(dǎo)管的直徑比對(duì)照組增加了39.29%和129.44%，根維管柱直徑比對(duì)照組增加了41.00%和251.29%。低劑量與高劑量之間苜蓿根的表皮厚度、皮層厚度、根直徑、原生導(dǎo)管直徑、后生導(dǎo)管直徑和維管柱直徑均差異顯著(P<0.05)。輻射對(duì)根的維管柱直徑和根厚度影響最大，其次為原生導(dǎo)管直徑、后生導(dǎo)管直徑和表皮厚度，對(duì)皮層厚度影響最小。

表1 60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗根顯微結(jié)構(gòu)的特征Table 1 Root structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著, 下同

Note: Different small letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

圖1 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗根解剖結(jié)構(gòu)Fig.1 Roots anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：圖中1，2，3，4和5依次為輻射劑量0,600,900,1 200和1 500 Gy時(shí)根的顯微結(jié)構(gòu)(×40)；6，7，8，9和10依次為輻射劑量0,600,900,1 200和1 500 Gy時(shí)根的顯微結(jié)構(gòu)(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×40), and the 6, 7, 8, 9 and 10 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×400)

2.2 60Co-γ射線輻射對(duì)苜蓿莖顯微結(jié)構(gòu)的影響

莖的顯微結(jié)構(gòu)由表皮、皮層、維管束和髓組成(圖2)。在不同劑量的60Co-γ射線輻射處理下，苜蓿莖的表皮和皮層薄壁厚度、維管束和髓直徑均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)輻射劑量達(dá)1 500 Gy時(shí)，苜蓿莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑均達(dá)到最大值。

經(jīng)過(guò)不同輻射劑量處理后，苜蓿莖的表皮和皮層薄壁細(xì)胞厚度及維管束直徑和髓直徑均產(chǎn)生不同程度的變化(表2)。當(dāng)輻射劑量為600和1 500 Gy時(shí)，其莖的表皮厚度與對(duì)照組比較增加了23.23%和59.01%，皮層薄壁細(xì)胞厚度與對(duì)照比較增加了1.74%和24.48%，維管束直徑與對(duì)照比較增加了9.95%和52.72%，髓的直徑與對(duì)照比較增加了20.42%和69.07%。除600和900 Gy輻射劑量外的皮層薄壁細(xì)胞厚度外，其它輻射劑量的苜蓿莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑與對(duì)照比較均差異顯著(P<0.05)，特別是高輻射劑量對(duì)苜蓿莖的顯微結(jié)構(gòu)的影響更大。輻射對(duì)莖的表皮厚度、維管束直徑和髓的直徑影響比較大，對(duì)皮層薄壁細(xì)胞厚度影響最小。

2.3 60Co-γ射線輻射對(duì)苜蓿葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響

葉的顯微結(jié)構(gòu)由上下表皮、葉肉和葉脈組成(圖3)。在不同劑量的60Co-γ射線輻射處理下，苜蓿葉片的上表皮、下表皮、葉片、柵欄組織、海綿組織脈凸起厚度均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)輻射劑量達(dá)1 500 Gy時(shí)，苜蓿葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均達(dá)到最大值。

經(jīng)不同輻射劑量處理后，苜蓿葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均產(chǎn)生不同程度的變化(表3)。當(dāng)輻射劑量為600和1 500 Gy時(shí)，其葉片厚度分別比對(duì)照組增加了6.43%和30.86%，上表皮厚度分別比對(duì)照組增加了3.95%和47.29%，下表皮厚度分別比對(duì)照組增加了4.39%和37.78%，葉脈凸起的厚度分別比對(duì)照組增加了4.09%和16.60%，柵欄組織厚度分別比對(duì)照組增加了8.06%和23.64%，海綿組織厚度分別比對(duì)照組增加了6.45%和26.96%。各輻射組與對(duì)照組間比較，在葉片的厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均差異性顯著(P<0.05)，輻射組之間比較，低劑量與高劑量輻射組間差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明60Co-γ射線輻射對(duì)苜蓿葉片的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，特別是高劑量輻射對(duì)葉片結(jié)構(gòu)影響極大。

表2 60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗莖顯微結(jié)構(gòu)的特征Table 2 Stem structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

圖2 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗莖解剖結(jié)構(gòu)Fig.2 Stems anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5為輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時(shí)莖的顯微結(jié)構(gòu)(×40)， 6，7，8，9和10為輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時(shí)莖的顯微結(jié)構(gòu)(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of stems were in order of rsdiation dose of 0,600,900,1 200,1 500 Gy(×40),and the 6,7,8,9 and 10 micrographs of the stems were in order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

表3 不同劑量60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗葉片結(jié)構(gòu)特征Table 3 Leaf structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

圖3 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)Fig.3 Leaves anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5分別為對(duì)照和輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時(shí)葉片的顯微結(jié)構(gòu)(×40)， 6，7，8，9和10分別為對(duì)照和輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時(shí)葉片的顯微結(jié)構(gòu)(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the leaves were in the ovder of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×40),and 6,7,8,9 and 10 microraphs of the leaves were in the order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

苜蓿葉片有明顯的柵欄組織和海綿組織分化，其中葉片柵海比值、柵欄組織緊密程度和海綿組織的疏松程度見(jiàn)表4。不同輻射苜蓿葉片柵海比值均大于1，柵欄組織的厚度大于海綿組織的厚度。當(dāng)輻射劑量為600，900，1 200，1 500 Gy時(shí)苜蓿葉片的柵海比、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度和海綿組織結(jié)構(gòu)疏松程度均產(chǎn)生不同程度的影響。除輻射劑量為600 Gy時(shí)其柵海比與對(duì)照組比較增加時(shí)，其他輻射劑量的柵海比、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度和海綿組織結(jié)構(gòu)疏松程度均有減小的變化趨勢(shì)。輻射劑量為1 500 Gy時(shí)柵海比、柵欄組織緊實(shí)密度和海綿組織的疏松度分別比對(duì)照組減小了2.67%，25.00%和26.67%。60Co-γ射線輻射對(duì)苜蓿葉片的柵海比沒(méi)有顯著影響，但對(duì)柵欄組織的緊實(shí)密度、海綿組織的疏松度產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，各輻射組之間無(wú)顯著差異。輻射對(duì)葉片的上表皮厚度、葉片的厚度、下表皮厚度和柵欄組織厚度影響大，海綿組織的厚度、柵海比值、柵欄組織緊實(shí)密度和海綿組織疏松度影響比較大，葉脈凸起厚度影響最小。

表4 葉片顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of leaf microstructure parameters

3 討論與結(jié)論

根是植物吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最重要的器官，也是最先感受土壤逆境脅迫最重要的部位，莖是將根吸收的水、無(wú)機(jī)鹽、以及葉制造的的有機(jī)物進(jìn)行輸導(dǎo)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到干旱、鹽堿等不良環(huán)境條件的影響[8],植物會(huì)逐漸演化出各種各樣形態(tài)結(jié)構(gòu)以適應(yīng)逆境。

本研究中根莖葉的顯微結(jié)構(gòu)對(duì)60Co-γ射線的輻射劑量變化的反應(yīng)敏感，隨著輻射劑量的增加，苜蓿根部的表皮厚度，皮層厚度維管柱直徑、原生導(dǎo)管和后生導(dǎo)管的直徑均有增加的趨勢(shì)，這與植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)有相似之處。如朱宇旌等[9]發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫等逆境條件下，植物可以增加表皮、皮層薄壁細(xì)胞的厚度來(lái)抑制鹽脅迫等滲透脅迫對(duì)植物根系的危害。本研究中，隨著輻射劑量增加莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑也均有增加的變化趨勢(shì)，劉海學(xué)等研究[10]NaCl脅迫對(duì)向日葵幼苗生長(zhǎng)及莖組織解剖結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)莖的解剖結(jié)構(gòu)隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加而變化，薄壁細(xì)胞和皮層細(xì)胞層數(shù)明顯增多，皮層厚角組織層數(shù)也均有增加，這與本研究的結(jié)果一致。此外，隨著輻射劑量增加葉片厚度、上下表皮厚度、葉脈凸起厚度、海綿組織和柵欄組織厚度均有增加的趨勢(shì), 柵海比有減少的變化趨勢(shì)，這與寇建村等[11]研究不同紫花苜蓿品種葉片的旱生結(jié)構(gòu)和郭鵬等[12]對(duì)鹽堿脅迫下紫花苜蓿的生理學(xué)及解剖學(xué)特征的研究結(jié)果基本一致。根莖葉的顯微結(jié)構(gòu)可隨著環(huán)境的變化而變化，其結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)環(huán)境因子與植物的協(xié)同進(jìn)化。通過(guò)輻射使苜蓿根和莖的輸導(dǎo)能力增加，葉片的光合效率增強(qiáng)，這可能是植物可抵御外界輻射影響的一個(gè)重要原因。

綜上所述，60Co-γ射線輻射能夠顯著影響紫花苜蓿幼苗的根莖葉顯微結(jié)構(gòu)，不同劑量的60Co-γ射線輻射下苜蓿幼苗根、莖、葉顯微結(jié)構(gòu)差異顯著，當(dāng)輻射劑量為1 500 Gy時(shí)，與其它輻射劑量組別相比，所測(cè)各組織結(jié)構(gòu)指數(shù)均達(dá)到最大值。而輻射劑量為1 800 Gy時(shí)，苜蓿干種子出苗后真葉未能長(zhǎng)出，導(dǎo)致該輻射劑量下苜蓿無(wú)成苗，此輻射劑量可視為苜蓿種子60Co-γ射線輻射的致死劑量。