宋佳琦， ，

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/新疆西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

已有對(duì)生長(zhǎng)素(indole-3-acetic acid，IAA)的研究中，最先被發(fā)現(xiàn)的是生長(zhǎng)素可以調(diào)節(jié)植物的向性生長(zhǎng)，并在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素具有調(diào)控組織分化[1]、器官的形態(tài)建成[2]、頂端優(yōu)勢(shì)[3]和花期[4]等多種功能。最近的研究表明，生長(zhǎng)素在種子的休眠過(guò)程中起正向調(diào)控作用，因此生長(zhǎng)素是第二類促進(jìn)種子休眠的激素[5]。Wang等[6]和Liu等[7]在生長(zhǎng)素調(diào)控種子休眠的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ARF是種子休眠過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，其中ARF10和ARF16是直接參與到種子休眠調(diào)控過(guò)程的兩個(gè)關(guān)鍵ARF基因，這在分子水平上探討了生長(zhǎng)素調(diào)控種子休眠的機(jī)制。3-吲哚乙酸(3-Indole acetic acid，IAA)是應(yīng)用最廣并且生物活性最強(qiáng)的一種生長(zhǎng)素[8]，在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和羊草(Leymuschinensis)種子的萌發(fā)試驗(yàn)中，IAA對(duì)種子萌發(fā)的調(diào)控作用表現(xiàn)為：低濃度促進(jìn)種子萌發(fā)，高濃度抑制種子萌發(fā)，且植物對(duì)IAA濃度變化的響應(yīng)因植物的種類不同而具有差異[9-10]；用IAA處理白三葉(Trifoliumrepens)種子后進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，結(jié)果表明，用20mg·L-1的吲哚乙酸，可提高白三葉種子的萌發(fā)率，促進(jìn)胚根、胚芽的生長(zhǎng)[11]；用20mg·L-1的IAA處理林地鐵線蓮(Clematisflorida)種子，提高了種子萌發(fā)率，平均萌發(fā)時(shí)間也比對(duì)照短[12]。IAA在種子萌發(fā)時(shí)有重要的調(diào)控作用，并且外源IAA能影響種子的萌發(fā)。研究生長(zhǎng)素對(duì)種子萌發(fā)的影響多數(shù)集中于模式植物或經(jīng)濟(jì)作物，但對(duì)飼草作物的研究較少，有關(guān)激素調(diào)控紫花苜蓿種子萌發(fā)的研究鮮有報(bào)道。

本研究以紫花苜蓿為材料，分析了紫花苜蓿種子在不同萌發(fā)時(shí)期的內(nèi)源激素變化，及其與苜蓿種子萌發(fā)間的關(guān)系，并且通過(guò)外源IAA浸種處理，研究了外源IAA對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響，以期為研究苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程中的激素調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為新牧4號(hào)紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Xinmu No.4’)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)“西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)”省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 萌發(fā)試驗(yàn)

從供試樣品中隨機(jī)選取子粒飽滿，大小均勻的苜蓿種子(種子硬實(shí)率約為25%)，用10%的次氯酸鈉消毒5 min，取出后用蒸餾水沖洗3次。取出后均勻放置在濕潤(rùn)的三層濾紙培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為60 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h光照/12 h黑暗。用稱量法及時(shí)補(bǔ)充蒸餾水，防止各培養(yǎng)皿中水勢(shì)變動(dòng)。共計(jì)12皿，每皿50粒種子。

根據(jù)種子萌發(fā)形態(tài)，在未萌發(fā)種子(M1)、露白種子(M2)、肧根長(zhǎng)度1.0～1.2 cm種子(M3)、苗期種子(萌發(fā)第7天，M4)這四個(gè)時(shí)期取樣，樣品經(jīng)液氮冷凍后放入-20℃冰箱中保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定樣品中內(nèi)源激素脫落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、生長(zhǎng)素的含量。

1.3 外源生長(zhǎng)素處理

從供試樣品中隨機(jī)選取子粒飽滿，大小均勻的苜蓿種子，用10%的次氯酸鈉消毒5 min，取出后用蒸餾水沖洗3次。將消毒后的種子分別浸泡在5、10、20、30 mg·L-1IAA處理液中2 h，以蒸餾水為對(duì)照(CK)，取出后均勻放置在浸透不同濃度IAA溶液的三層濾紙培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為60 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h光照/12 h黑暗。每個(gè)處理3次重復(fù)，每皿50粒種子。用稱量法及時(shí)補(bǔ)充蒸餾水，防止各培養(yǎng)皿中水勢(shì)變動(dòng)。

種子以胚根突破種皮2 mm左右為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察記錄種子萌發(fā)數(shù)，第4天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率并測(cè)定苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)及生物量。萌發(fā)結(jié)束后取樣，每個(gè)處理取0.5～1 g幼苗子葉經(jīng)液氮速凍后置于-20℃的冰箱中，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定子葉中ABA、GA3、IAA的含量，試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。根據(jù)以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)下列指標(biāo)。

萌發(fā)率(%)=(第7天萌發(fā)種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100% ；

萌發(fā)勢(shì)(%)=(第4天萌發(fā)種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100% ；

萌發(fā)指數(shù)( GI )=∑( Gt/Dt )，式中：Gt為在不同時(shí)間的萌發(fā)數(shù)；Dt為萌發(fā)日數(shù)；

活力指數(shù)( VI )=萌發(fā)指數(shù)×苗長(zhǎng)

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2010進(jìn)行整理，使用Origin 8.0軟件作圖。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿種子不同萌發(fā)時(shí)期內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化

苜蓿種子萌發(fā)的不同階段IAA含量在11.06～11.39 ng·g-1FW之間，M1到M2時(shí)期種子中IAA含量減少0.06 ng·g-1FW，M2到M4時(shí)期IAA含量逐漸增多并且M3到M4時(shí)期顯著增加0.18 ng·g-1FW(P<0.05)。由表1可知，GA3含量變化幅度最大，隨著苜蓿種子的萌發(fā)進(jìn)程，種子中GA3含量逐漸上升，在M1到M2期間GA3含量顯著升高，M2比M1時(shí)期增長(zhǎng)1.75 ng·g-1FW(P<0.05)。ABA的含量變化是種子破除休眠的關(guān)鍵條件之一，ABA含量在M1到M3時(shí)期逐漸下降，M2較M1時(shí)期ABA含量顯著下降0.35 ng·g-1FW(P<0.05)，但在M3到M4期間，ABA含量略有回升。

表1 不同萌發(fā)時(shí)期苜蓿種子中內(nèi)源激素的含量Table 1 The content of endogenous hormones in different germination stages of alfalfa seeds

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note: Different letters in the same line indicate significant difference at the 0.05 level, the same as below

2.2 不同萌發(fā)時(shí)期苜蓿種子內(nèi)源激素間的比值變化

苜蓿種子萌發(fā)期間種子中各內(nèi)源激素含量上下浮動(dòng)，同時(shí)各內(nèi)源激素間的比例也有變化。從圖1可以看出，IAA/ABA、GA3/ABA變化趨勢(shì)相似，在苜蓿出苗期(M1至M2時(shí)期)大幅度上升。在生根期(M2至M3時(shí)期)IAA/ABA增長(zhǎng)幅度大于GA3/ABA，M3到M4期間IAA/ABA與GA3/ABA下降幅度相似。在苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素間的比例呈現(xiàn)不同變化，ABA與GA3、IAA具有顯著的拮抗作用。

圖1 不同萌發(fā)時(shí)期苜蓿種子中IAA/ABA、GA3/ABA的變化Fig.1 Changes of IAA / ABA and GA3 / ABA in alfalfa seeds during different germination stages注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different letters indicate significant difference at the 0.05 level

2.3 外源生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)苜蓿種子萌發(fā)后子葉中內(nèi)源激素含量變化的影響

不同濃度IAA處理下，子葉中IAA、GA3、ABA的變化對(duì)不同濃度IAA的響應(yīng)不同。如表2所示，子葉中IAA的含量隨著處理濃度的增長(zhǎng)逐漸增多，當(dāng)處理濃度為30 mg·L-1時(shí)，子葉中IAA含量最大為12.15 ng·g-1FW且顯著高于其他處理(P<0.05)，表明外源IAA浸種后，促進(jìn)子葉合成IAA。

子葉中GA3含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)處理濃度為20 mg·L-1時(shí)，子葉中GA3的含量最大，顯著高于對(duì)照(P<0.05)，但30 mg·L-1處理下與對(duì)照相比子葉中GA3含量減少0.36 ng·g-1FW。脫落酸的含量變化與赤霉素和生長(zhǎng)素均不同，不同濃度IAA處理下，子葉中ABA變化呈波浪型，當(dāng)IAA處理濃度為10 mg·L-1時(shí)，子葉中ABA含量最少為3.47 ng·g-1FW顯著低于對(duì)照(P<0.05)。

表2 外源IAA處理后苜蓿子葉中內(nèi)源激素的含量變化Table 2 The change in content of endogenous hormones in alfalfa cotyledons after treated with exogenous IAA/ng·g-1 FW

2.4 外源生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)特性的影響

通過(guò)比較不同濃度IAA浸種對(duì)紫花苜蓿苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)的影響可知，在IAA濃度為30 mg·L-1時(shí)，苜蓿的苗長(zhǎng)比對(duì)照減少0.03 cm，但無(wú)顯著差異，其它處理均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。根長(zhǎng)對(duì)IAA的響應(yīng)與苗長(zhǎng)不同，不同處理的IAA均可促進(jìn)根的生長(zhǎng)。當(dāng)IAA濃度為10 mg·L-1時(shí)，苗長(zhǎng)及根長(zhǎng)生長(zhǎng)最好分別高于對(duì)照43.1%和22.5%，其次為20 mg·L-1的處理。由表3可知，隨著IAA濃度的升高，根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)及生物量呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，表明苜蓿種子萌發(fā)后的根、芽生長(zhǎng)對(duì)IAA響應(yīng)較敏感，適宜濃度的IAA促進(jìn)根和芽的生長(zhǎng)，但高濃度的IAA會(huì)明顯抑制芽的生長(zhǎng)。IAA濃度為10 mg·L-1時(shí)，萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)均顯著高于其他處理(P<0.05)，相比對(duì)照組的萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)分別提高了18.66%和31.81%，30 mg·L-1處理下種子的活力指數(shù)比對(duì)照下降了6.64%，10 mg·L-1和20 mg·L-1處理下活力指數(shù)及萌發(fā)指數(shù)顯著高于對(duì)照(P<0.05)。綜上所述，10 mg·L-1和20 mg·L-1的IAA可以促進(jìn)紫花苜蓿種子的萌發(fā)，但濃度為30 mg·L-1時(shí)，種子的萌發(fā)參數(shù)均低于對(duì)照，不利于種子的萌發(fā)。

表3 不同濃度IAA處理下苜蓿種子萌發(fā)參數(shù)的變化Table 3 The change in germination parameters of alfalfa seeds after treated with IAA at different concentrations

3.1 苜蓿種子萌發(fā)不同時(shí)期內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化

種子萌發(fā)是植物生命活動(dòng)開(kāi)始的標(biāo)志之一，在多種激素的協(xié)調(diào)下完成[13]，種子生理休眠的誘導(dǎo)[14]及終止[15]在多種內(nèi)源激素的協(xié)調(diào)、拮抗作用下完成。種子萌發(fā)時(shí)地上及地下生長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)源激素的含量變化各不相同。研究已證實(shí)ABA可以抑制種子萌發(fā)、維持種子休眠[16-17]。在本研究中紫花苜蓿種子萌發(fā)時(shí)根系的生長(zhǎng)過(guò)程(M1至M3時(shí)期)，種子中ABA含量逐漸下降，因?yàn)榇蚱品N子的休眠、胚根突破種皮均與ABA的含量有關(guān)。在種子萌發(fā)時(shí)首先需要吸脹，種子吸脹后，發(fā)生的重要現(xiàn)象之一就是ABA含量下降，并且ABA的敏感性降低，這是種子萌發(fā)的先決條件[18-19]。M3到M4時(shí)期過(guò)程中，ABA含量略有回升，可能是吸脹結(jié)束后，種子重新合成ABA，因?yàn)锳BA能夠增加液泡中糖的濃度，提高根系細(xì)胞吸取營(yíng)養(yǎng)的能力，促進(jìn)出苗[20]。

本試驗(yàn)中苜蓿種子萌發(fā)經(jīng)歷M1到M2時(shí)期時(shí)，ABA含量減少，GA3含量驟升，這與油茶(Camelliaoleifera)[21]、鳳丹(TreePeony)[22]、重樓(RhizomaParidisYunnanensis)[23]等種子萌發(fā)過(guò)程中ABA與GA3含量變化相似。GA3促進(jìn)種子萌發(fā)的作用在多種植物上已被證實(shí)[24]。在種子萌發(fā)時(shí)ABA與GA3表現(xiàn)出顯著的拮抗作用[25]。在苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程中GA3含量逐漸上升，這可能與GA3的大量合成有利于動(dòng)員種子的儲(chǔ)存物質(zhì)和胚的擴(kuò)張有關(guān)[26]，并且種子萌發(fā)時(shí)積累大量GA3可以促進(jìn)軟化屏障組織水解酶的表達(dá)，降低胚根突破種皮的機(jī)械阻力，利于種子萌發(fā)[27]。

有研究證實(shí)IAA與ABA在種子萌發(fā)時(shí)具有相似作用，均表現(xiàn)為正向調(diào)控種子休眠[5]。本研究中，苜蓿種子在M1～M2時(shí)期，IAA含量下降，表明苜蓿種子萌發(fā)時(shí)，種子休眠的解除受IAA和ABA共同作用。生長(zhǎng)素在植物頂端組織和幼嫩葉片中合成[28]，低濃度的IAA促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，濃度過(guò)高則抑制植物的生長(zhǎng)。在苜蓿種子萌發(fā)后期，IAA含量逐漸增多，表明苜蓿地上和地下部分的生長(zhǎng)需要合成IAA。

種子的萌發(fā)不僅受ABA、IAA、GA3等內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)，也與各內(nèi)源激素間的平衡有關(guān)，特別是促進(jìn)生長(zhǎng)類激素與抑制生長(zhǎng)類激素間的平衡[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苜蓿種子在不同萌發(fā)時(shí)期，GA3/ABA、IAA/ABA的比值整體升高，說(shuō)明苜蓿萌發(fā)時(shí)激素間的平衡作用，對(duì)解除種子休眠，促進(jìn)萌發(fā)有重要影響。Cadman[30]也認(rèn)為GA/ABA值升高是種子解除休眠的原因，GA/ABA值呈上升趨勢(shì)會(huì)打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。

3.2 外源IAA對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的影響

已有研究使用IAA浸種處理黃瓜(Cucumissativus)[31]、黑草(Buchneracruciata)[32]、藍(lán)靛果忍冬(Loniceracaerulea)[33]等種子，發(fā)現(xiàn)IAA對(duì)種子萌發(fā)的影響，均呈現(xiàn)低濃度的IAA促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)，而較高濃度的IAA會(huì)降低種子的萌發(fā)率。本研究也得出了相似的結(jié)果，低濃度(10 mg·L-1)的IAA可促進(jìn)紫花苜蓿種子的萌發(fā)，并且促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。外源IAA促進(jìn)苜蓿種子萌發(fā)率及幼苗的生長(zhǎng)，這與苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素的變化息息相關(guān)。種子萌發(fā)時(shí)GA和ABA表現(xiàn)為拮抗作用，ABA含量的下降是GA含量升高和敏感性增強(qiáng)的必要因素[34]。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著IAA處理濃度遞增，紫花苜蓿種子萌發(fā)時(shí)子葉中GA3含量逐漸增多，同時(shí)ABA含量逐漸減少，說(shuō)明在外源IAA處理下，苜蓿種子萌發(fā)過(guò)程中GA和ABA依然有顯著的拮抗作用。近期研究表明，ABA的含量變化取決于CYP707A2基因的活性[19]。在試驗(yàn)中通過(guò)IAA浸種后可能影響紫花苜蓿種子中CYP707A2基因的表達(dá)，導(dǎo)致子葉中ABA含量下降，促使GA的合成基因上調(diào)。

綜上所述，外源激素IAA影響紫花苜蓿種子萌發(fā)時(shí)GA3、ABA含量，進(jìn)而影響紫花苜蓿種子萌發(fā)。但激素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，外源IAA如何影響苜蓿種子萌發(fā)時(shí)內(nèi)源激素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還有待進(jìn)一步研究。