許英一， ，

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3. 黑龍江省畜牧研究所， 黑龍江 齊齊哈爾161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為多年生豆科牧草，是重要的飼料作物。分布廣泛，產(chǎn)草量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性好，適應(yīng)性強(qiáng)，被稱為“牧草之王”[1]。紫花苜蓿中含有植物葉蛋白、皂苷、黃酮類、類胡蘿卜素、酚醛酸等多種生物活性成分，因此，苜蓿在抗衰老、抗菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、護(hù)肝、抑制高血壓、高血脂、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防心血管疾病及止痛鎮(zhèn)痛等方面都具有良好的作用[2-3]。同時(shí)黃酮類化合物也是重要的功能食品添加劑、飼料添加劑[4]、天然抗氧化劑, 具有保鮮和護(hù)膚美容作用[5]。

目前，人們對(duì)大豆、辣木(MoringaoleiferaL.) 等植物中黃酮類化合物的提取及抗氧化性進(jìn)行了大量研究，而對(duì)紫花苜蓿提取及抗氧化性研究很少。岳愛琴等[6]采用有機(jī)溶劑法提取大豆中異黃酮，得率為9.18%；岳秀潔等[7]采用超聲提取辣木葉黃酮，得率為(48.93±0.44)mg·g-1；張?jiān)伱返萚8]采用微波輔助提取苜蓿黃酮，黃酮得率僅為4.92mg·g-1，限制了苜蓿黃酮在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用和其抗氧化性等功能特性的研究。提取黃酮的方法有溶劑浸提法、微波提取法、超臨界 CO2萃取法、纖維素酶法、超聲波提取法等[9]。近年來，超聲波提取技術(shù)被廣泛用來萃取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)、動(dòng)物組織漿的毒質(zhì)等[10-11]。該技術(shù)具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)。本研究旨在采用對(duì)超聲波輔助提取苜蓿葉黃酮工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)提取的總黃酮進(jìn)行抗氧化性能的研究。為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用紫花苜蓿黃酮類化合物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紫花苜蓿，黑龍江省畜牧研究所提供。DPPH，美國(guó)sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

722N 可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS224S 電子天平， 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DE 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；WK-600高速藥物粉碎機(jī)，青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；日立CR21G高速冷凍離心機(jī)，天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司；HHS21-4 電熱恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1提取方法

(1)乙醇浸提法 準(zhǔn)確稱取 5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末置于 500 mL 錐形瓶中，加入 80% 的乙醇 100 mL 回流浸提3 h，收集浸提液，濾渣重復(fù)浸提1次，合并2次的浸提液，測(cè)定總黃酮得率。

(2)超聲波輔助水提取法 準(zhǔn)確稱取 5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末置于 250 mL 錐形瓶中，加入 100 mL 蒸餾水，在溫度為60℃、超聲功率為180 w的條件下超聲提取 30 min，收集浸提液，濾渣重復(fù)浸提1次，合并2次的浸提液，測(cè)定總黃酮得率。

(3)超聲波輔助乙醇提取法 準(zhǔn)確稱取 5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末置于 250 mL 錐形瓶中，加入100 mL 80% 的乙醇，在溫度為60℃、超聲功率為180 w的條件下超聲提取30 min，收集浸提液，濾渣重復(fù)浸提1次，合并2次的浸提液，測(cè)定總黃酮得率。

1.2.2超聲波輔助乙醇提取紫花苜蓿葉總黃酮的工藝優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5.0 g 經(jīng)過處理的紫花苜蓿葉粉末，固定料液比1:20(g·mL-1)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度50℃，提取時(shí)間30 min，超聲功率180 w為單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。但研究某一因素時(shí)，其他條件保持不變。乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為 60%，70%，80%，90%，100%，提取溫度分別為20，30，40，50，60 ℃，提取時(shí)間分別為10，20，30，40，50 min，超聲功率分別為120，150，180，210，240 w，按上述設(shè)計(jì)做單因素試驗(yàn)。所得浸提液按標(biāo)準(zhǔn)曲線處理方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率，每組3次重復(fù)。

(2)正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 L16(45)正交試驗(yàn)對(duì)紫花苜蓿葉總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定正交試驗(yàn)因素水平，見表1。

1.2.3苜蓿葉總黃酮類化合物的測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照白吉慶等[12]文獻(xiàn)中的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用 NaNO2/Al( NO3)3顯色法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=11.025x+0.011，R2=0.9990，表明在0.02～0.1 mg·mL-1范圍內(nèi)溶液吸光度和蘆丁對(duì)照品的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

(2)苜蓿葉總黃酮含量測(cè)定

吸取一定體積苜蓿葉黃酮提取液，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法測(cè)定苜蓿葉黃酮的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到總黃酮質(zhì)量濃度(C)，按公式(1)計(jì)算樣品中總黃酮得率(P)。

(1)

式(1)中，C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；N—提取液稀釋倍數(shù)；V—苜?？傸S酮原液的總體積(mL)；m—苜蓿原料質(zhì)量(g)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4抗氧化活性測(cè)定

(1) DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Shimada[13]的方法略做調(diào)整。分別取稀釋后不同濃度樣液2 mL于試管內(nèi)，加入0.04 g·L-1的DPPH自由基無(wú)水乙醇溶液2 mL，混合均勻，避光30 min，在517 nm處測(cè)得的吸光值記為Ai。另取樣液2 mL放于試管中，加入2 mL無(wú)水乙醇，避光反應(yīng)20 min，在517 nm下測(cè)定的吸光值記為Aj。用0.04 g·L-1的無(wú)水乙醇溶液2 mL與無(wú)水乙醇2 mL反應(yīng)作為參比，吸光值記為A0。同時(shí)以VC做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算公式為：

(2)

(2) 還原力的測(cè)定

參照Oyaizu[14]的方法略做改動(dòng)。取2.0 mL稀釋后不同濃度樣液于試管中，分別加入0.2 mol·L-1pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.0 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液2.0 mL，混勻，在50 ℃水浴下保溫20 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸(TCA)溶液2.0 mL，震蕩搖勻后以4 000 r·min-1離心10 min。取離心后上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的FeCl3溶液，震蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10 min，在700 nm下進(jìn)行比色，以去離子水作為空白，同時(shí)以VC做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測(cè)定結(jié)果，對(duì)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析，并用Duncan 法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，不同字母表示組間比較差異顯著；采用Excel 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法比較

3種提取方法對(duì)黃酮提取效果的影響結(jié)果如圖1 所示，3種提取方法中，超聲波輔助乙醇法提取苜蓿葉總黃酮得率較高，且與另外2種方法總黃酮得率相比，均具有顯著性差異(P<0.05)，因此選擇超聲波輔助乙醇法進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 提取方法的比較Fig.1 Comparison of extraction method注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note：Different letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對(duì)對(duì)總黃酮得率的影響如圖2所示，4個(gè)因素對(duì)總黃酮得率的影響均具有顯著性差異(P<0.05)。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%；最佳提取溫度為50℃；最佳提取時(shí)間為30 min；最佳超聲功率為180 w。

圖2 4個(gè)因素對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of four different factors on total flavonoid yield注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)Note: Different letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析及多重比較

由表2 可知，通過極值 R 大小得出各因素對(duì)苜蓿葉總黃酮得率影響的順序?yàn)椋禾崛囟?超聲功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間。 由表 3 方差分析得出：提取溫度、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響差異極顯著(P<0.01)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響顯著(P< 0.05)。由表 4 多重比較分析得出：苜蓿葉總黃酮最佳工藝參數(shù)為A1B4C2D3。

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal design

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 The variance analysis form of orthogonal design

注：*表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)

Note: * indicates significant at the 0.05 level；**indicates extremely significant at the 0.01 level

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率4因素多重比較結(jié)果(SSR法)Table 4 The multiple comparison results of 4 factors on the ethanol volume fraction，extraction temperature，extractiontime and ultrasonic power(SSR Methods)

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定量苜蓿粉末3份，按上述最佳工藝參數(shù),即A1B4C2B3超聲提取，測(cè)定吸光度，得到苜蓿總黃酮得率為6.43 mg·g-1，大于正交試驗(yàn)中16個(gè)工藝參數(shù)的結(jié)果，即A1B4C2D3為最佳工藝參數(shù)，此時(shí)苜?？傸S酮得率為6.43 mg·g-1。

2.5 總黃酮抗氧化活性分析

2.5.1苜?？傸S酮對(duì)DPPH 自由基清除作用 苜蓿黃酮及抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果如圖6、圖7所示。從圖6可以看出，在苜?？傸S酮的劑量為0.2 ～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)呈一定的劑量效應(yīng)，隨著苜蓿黃酮的濃度的增大，對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。通過對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可以得出黃酮質(zhì)量濃度與清除率的回歸方程為y=71.57x+17.51 (R2=0.9863)，其半抑制濃度(IC50值)為0.608 mg·mL-1；陽(yáng)性對(duì)照Vc的濃度增大，其抑制率也增大，Vc的質(zhì)量濃度與清除率的回歸方程為y=8.0745x+19.139 (R2= 0.9717)，Vc在濃度很低時(shí)就體現(xiàn)出了抑制性，其半抑制濃度(IC50值為4.952 μg·mL-1)，由此可看出在同等質(zhì)量的條件下苜?？傸S酮的抑制率低于Vc的抑制率。DPPH自由基清除率苜蓿葉總黃酮相當(dāng)于Vc的量即Vc當(dāng)量為8.145 μg·mg-1。

圖6 苜蓿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率Fig.6 DPPH radical scavenging capacity oftotal flavonoids from alfalfa leaf

圖7 Vc對(duì)DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of Vc

2.5.2苜?？傸S酮的還原力 苜?？傸S酮及抗壞血酸的還原力測(cè)定結(jié)果如圖8、圖9所示。苜蓿葉總黃酮和Vc的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，且呈明顯的量效關(guān)系。雖然其還原力低于Vc，但還是表現(xiàn)出了較強(qiáng)的還原力。

圖8 苜蓿葉總黃酮的還原力Fig.8 Reducing power of total flavonoidsfrom alfalfa leaf

圖9 Vc的還原力Fig.9 Reducing power of Vc

3 討論與結(jié)論

3.1 提取方法的選擇

黃酮類化合物的制備方法主要有水提取法、有機(jī)溶劑提取法、二氧化碳超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法等。水提法提取率較低，提取液易腐敗變質(zhì)，且后續(xù)的過濾、干燥除去溶劑等操作困難；有機(jī)溶劑提取法克服了水提法產(chǎn)物存放易霉變等缺點(diǎn)，提取率高，這與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在乙醇中難溶或微溶有關(guān)。后續(xù)的干燥、過濾等操作也比較容易進(jìn)行；超聲波輔助提取技術(shù)，因具有提取時(shí)間短、提取效率高、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)[15]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于很多植物黃酮的提取。最常見的黃酮類化合物的提取方法是有機(jī)溶劑提取法，目前也有一些文獻(xiàn)采用超聲波輔助乙醇提取法，但采用超聲波輔助水提取法提取黃酮類化合物的還未見報(bào)道。本試驗(yàn)比較了乙醇浸提法、超聲波輔助水提取法和超聲波輔助乙醇提取法3種方法的總黃酮得率，分別為(4.23±0.08)mg·g-1、(4.59±0.08)mg·g-1和(5.44±0.12)mg·g-1，超聲波輔助乙醇提取法的總黃酮得率最高，且與另2種方法總黃酮得率相比，均具有顯著差異。因此采用超聲波輔助乙醇提取法。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明超聲波輔助乙醇提取苜蓿葉總黃酮的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%、提取溫度 60 ℃、提取時(shí)間 30 min、超聲功率180 w，苜蓿葉總黃酮得率為6.43 mg·g-1，得率顯著高于趙婭敏等[16]超聲輔助提取甘肅紫花苜蓿黃酮得率(1.7643 mg·g-1)，同時(shí)也高于劉香萍等[17]超聲輔助提取紫花苜蓿葉黃酮得率(5.29 mg·g-1)。關(guān)于苜蓿葉總黃酮的研究及其分離純化目前已經(jīng)取得初步進(jìn)展，本研究?jī)H對(duì)苜蓿葉總黃酮提取方法的優(yōu)化進(jìn)行了初步的探討，為后續(xù)苜蓿葉總黃酮的分離純化提供技術(shù)支撐，而苜蓿葉總黃酮的主要成分的分離以及藥用價(jià)值有待于做進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 苜蓿葉總黃酮抗氧化活性

黃酮類化合物除作為藥品用于臨床[18]，還可作為食品、化妝品等的天然添加劑，已有研究以黃酮為功能指標(biāo)，研制和開發(fā)了山楂葉黃酮的保健類產(chǎn)品，具有很好的發(fā)展前景。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，在可見光區(qū)有特征吸收，比色測(cè)定簡(jiǎn)便、快捷。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)而使乙醇溶液顏色變淺，最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小，且顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)呈劑量關(guān)系，因此可用于物質(zhì)清除自由基的研究與天然抗氧化劑的篩選[19]。超聲波輔助提取的苜蓿葉總黃酮對(duì)DPPH·清除率可達(dá)85.76%，這與朱宇旌等[20]研究表明的苜蓿黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性的結(jié)果相一致；苜蓿葉總黃酮清除DPPH·的 Vc當(dāng)量為8.145 μg·mg-1。還原力是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的重要指標(biāo)，該方法的機(jī)理是抗氧化劑將Fe3+還原成Fe2+的形式，從而中斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。還原能力的大小可以通過在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度來檢測(cè)，吸光度越大還原力越大，抗氧化能力越強(qiáng)[21]。當(dāng)苜蓿葉總黃酮的濃度為1 mg·mL-1時(shí)，其還原力達(dá)0.82，但不及VC。苜蓿葉總黃酮抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的升高逐漸增強(qiáng)，但不及VC,這一點(diǎn)與胡衛(wèi)成[22]研究表明的蓮蓬殼具有較強(qiáng)的抗氧化性的結(jié)果相一致。說明超聲提取的苜蓿葉總黃酮具有較好的抗氧化活性，可用作天然的抗氧化劑原料。該研究也為苜蓿葉總黃酮資源的進(jìn)一步綜合利用提供了重要依據(jù)。