于 琰，WERNBERG Thomas，DE BETTIGNIES Thibaut，3，潘耀茹，李 超，林 芳，周朝生，黃志行，吳嘉平，肖 溪，*

(1.浙江大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 舟山 316021； 2.西澳大學(xué) 植物生物學(xué)學(xué)院，澳大利亞 珀斯 6009； 3.國家自然歷史博物館，法國 巴黎 75005； 4.浙江大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 310058； 5.浙江海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005)

由人類活動引起的近岸海域富營養(yǎng)化已成為全球海洋環(huán)境研究的焦點之一[1-2]。而大型海藻養(yǎng)殖被認為是一種環(huán)境友好型的近海富營養(yǎng)化生物修復(fù)方法[3-5]。大型海藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)重要的初級生產(chǎn)者，可為海洋生物提供氧氣、食物和棲息地[6]，緩沖海浪對海岸的沖擊侵蝕，同時移除過量營養(yǎng)鹽[7-10]。研究表明，1 hm2養(yǎng)殖的大型海藻可移除相當于17.8 hm2和126.7 hm2中國近岸海域海水中的氮和磷[11]。此外，養(yǎng)殖的大型海藻也是許多亞洲國家和地區(qū)重要的食物來源[12-13]。目前我國大型海藻養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的47.9%，占全球總產(chǎn)值的47.4%[14]。因此，相較于物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)等其他修復(fù)技術(shù)，大型海藻養(yǎng)殖修復(fù)富營養(yǎng)化水域不失為一種最經(jīng)濟安全有效的原位生物修復(fù)技術(shù)[8, 15-17]。然而，如何提高營養(yǎng)鹽生物修復(fù)效果和以細胞色素和富氮化合物為代表的生物質(zhì)含量是該生物修復(fù)技術(shù)所面臨的難點。營養(yǎng)鹽供給是影響海藻生長的重要因素[18]，之前的大部分研究都在低濃度或中濃度營養(yǎng)鹽條件下開展[19-20]，但在富營養(yǎng)化水域中營養(yǎng)鹽則不再成為限制因素。除該因素外，水流交換也在藻體生長時發(fā)揮重要作用[21]。水流速度增加能夠減小藻體表面擴散邊界層厚度從而加速養(yǎng)分和CO2的供應(yīng)與吸收，促進其生長[21-23]，同時加速藻體代謝產(chǎn)物如O2、OH-、過量的過氧化氫和鹵化有機物等物質(zhì)的移動[24]。當水流交換率由2 vol·d-1提高到8 vol·d-1時，硬石莼(Ulvarigida)生長率提高33.3 %[25]。當水流交換率由5 vol·d-1提高至10.2 vol·d-1時角叉菜(Chondruscanaliculatus)產(chǎn)量明顯提高[26]。巨型海帶(Macrocystispyrifera)的無機氮吸收速率在水流速度達到2～6 cm·s-1時達到最大[21， 27-28]，裙帶菜(Undariapinnatifida)則可能會更高(>10 cm·s-1)[29]。而低水流速度則可能通過降低傳質(zhì)限制從而減弱藻體凈光合作用效率，研究表明，當水流速度小于1 cm·s-1時，龍須菜(Gracilariaconferta)光合作用受到限制[24]。

本研究選取兩種我國近岸海域較為常見的大型海藻——羊棲菜(Sargassumfusiforme)和石莼(Ulvapertusa)作為實驗藻種，在實驗室環(huán)境中調(diào)控水流交換率，探究3種營養(yǎng)化程度海水應(yīng)用情境下兩種大型海藻的生長規(guī)律；并檢測藻體細胞色素(葉綠素a、胡蘿卜素)和富氮化合物(可溶性蛋白、可溶性碳水化合物)濃度的變化情況。并利用自行設(shè)計的旋轉(zhuǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)，進一步探究調(diào)控水流速度對兩藻種生長的影響。旨在明確富營養(yǎng)化條件下水流改變對兩種大型海藻生長和生物質(zhì)積累的作用，為今后富營養(yǎng)化海域大型海藻生物修復(fù)選種工作提供實驗依據(jù)，以期優(yōu)化基于大型海藻的富營養(yǎng)化海域和海水養(yǎng)殖污水凈化工藝，提高其營養(yǎng)鹽移除效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2015年9月至11月，在我國浙江省溫州市洞頭縣，浙江水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所洞頭基地(27°51′42″， 121°11′06″)養(yǎng)殖海域采集褐藻羊棲菜(Sargassumfusiforme)和綠藻石莼(Ulvapertusa)。用過濾后的自然海水清洗藻體表面，去除泥沙和附生動植物。暫養(yǎng)在鹽度28‰的過濾自然海水中，用冷水機將溫度控制為18 ℃(HS-90A，廣東海利有限公司，中國)，熒光燈提供光照，強度為120 μmol photons·m-2·s-1，光照周期為12 h/12 h(L/D)。

1.2 實驗設(shè)計

根據(jù)目前我國近岸富營養(yǎng)化狀況[30]并設(shè)想極端情況，在自主設(shè)計實驗體系下，模擬近岸富營養(yǎng)化海水、養(yǎng)蝦池廢水及極度富營養(yǎng)化海水3種環(huán)境，對3個110 cm×100 cm×40 cm大玻璃水缸中過濾海水的營養(yǎng)鹽進行加富，使最終銨鹽和磷酸鹽濃度分別達到25 μmol·L-1與2.5 μmol·L-1，50 μmol·L-1與5.0 μmol·L-1，100 μmol·L-1與10.0 μmol·L-1，在每個大缸分別放入5個20 cm×36 cm×25 cm小玻璃水缸并在每個小水缸中投放暫養(yǎng)兩天且健康程度與生長狀況基本一致的藻體，用小功率水泵(HJ-2200，森森有限公司，中國)與液體轉(zhuǎn)子流量計(LZB-10，余姚銀環(huán)流量儀表有限公司，中國)調(diào)控使其達到設(shè)定的水流交換率0、25、50、100及200 vol·d-1。光照強度、光照周期與鹽度等其他條件與暫養(yǎng)條件保持一致，每2 d更換一次營養(yǎng)鹽加富海水。每個處理重復(fù)6個平行樣，培養(yǎng)周期為14 d。

中試同樣以暫養(yǎng)2 d且健康程度與生長狀況基本一致的羊棲菜、石莼藻體作為實驗材料，在極度富營養(yǎng)化海水情境的大玻璃水缸中將藻體固定于自主設(shè)計的旋轉(zhuǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)最外圈處，半徑1/2處和半徑1/3處，通過轉(zhuǎn)速調(diào)整按鈕將轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動線速度達到0.3 m·s-1，則對應(yīng)半徑1/2處和半徑1/3處的轉(zhuǎn)動線速度則為0.15和0.10 m·s-1。光照強度、光照周期與鹽度等其他條件與暫養(yǎng)條件保持一致，每兩天更換一次營養(yǎng)鹽加富海水。每個處理重復(fù)6個平行樣，培養(yǎng)周期為12 d。

1.3 生理生化指標測試

1.3.1 比生長速率

在藻類生理生化研究領(lǐng)域中，比生長速率(specific growth rate，SGR)是衡量大型藻類生長狀況的經(jīng)典指標之一。稱量前用吸水紙或者毛巾輕輕擦拭藻體表面，使藻體表面干燥程度盡量保持一致，稱量藻體實驗前后的鮮質(zhì)量來計算比生長速率[31]。

1.3.2 光合色素

光合色素(photosynthetic pigment)指標包括葉綠素a (chlorophyll a， Chl a)和胡蘿卜素(carotene， Car)，其含量的測定均采用丙醇提取法[32]。采用分光光度計(T6，上海元析有限公司，中國)在450 nm、666 nm和730 nm波長處測定吸光值。

1.3.3 可溶性蛋白

可溶性蛋白含量(Soluble Protein， SP)的測定采用考馬斯亮藍G-250法[33]。用分光光度計在595 nm波長測定吸光值。

1.3.4 可溶性碳水化合物

可溶性碳水化合物(soluble carbohydrate，SC)含量測定則采用苯酚—硫酸法[34]。用分光光度計在490 nm波長處測定吸光值。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2007、SPSS 20.0、R語言對每組的6個平行樣進行分析，所有處理組進行雙因素方差分析，設(shè)置顯著水平為P<0.05，并采用Tukey’s HSD方法檢驗各處理組顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 比生長率

圖1中在養(yǎng)蝦場廢水應(yīng)用情境下羊棲菜比生長率明顯高于其他水流處理組，且當水流交換率為200 vol·d-1達到最大值(4.34 ± 0.11)%·d-1，而在極度富營養(yǎng)化海水應(yīng)用情境下出現(xiàn)最小值(0.67 ± 0.29)%·d-1。表1雙因素方差分析結(jié)果顯示，水流交換率和富營養(yǎng)化應(yīng)用情境兩因素的交互作用對羊棲菜比生長率影響顯著(P<0.05)，富營養(yǎng)化應(yīng)用情境即營養(yǎng)鹽濃度對羊棲菜比生長率有極顯著影響(P<0.01)。所有培養(yǎng)條件下，石莼的生長均明顯優(yōu)于羊棲菜。養(yǎng)蝦場廢水、極度富營養(yǎng)化海水各處理組石莼生長狀況均優(yōu)于近岸富營養(yǎng)化海水應(yīng)用情境下。當水流交換率為100 vol·d-1，中、高濃度營養(yǎng)鹽即養(yǎng)蝦場廢水、極度富營養(yǎng)化海水條件下石莼比生長率分別為(6.31±1.42)%·d-1、(8.00±0.79)%·d-1，明顯高于其他處理組。富營養(yǎng)化應(yīng)用情境和水流交換率分別對石莼比生長率有極顯著影響(P<0.01)和顯著影響(P<0.05)。

2.2 生化指標

如圖2所示，羊棲菜的所有處理組中，水流交換率為0 vol·d-1、養(yǎng)蝦場廢水模擬環(huán)境下葉綠素a濃度達到最高(0.327±0.017)mg·g-1，其他處理組其含量維持在0.158～0.309 mg·g-1。類胡蘿卜素濃度則在水流交換率為200 vol·d-1、養(yǎng)蝦場廢水模擬環(huán)境下達到最高(0.054±0.018)mg·g-1，其他組分其含量維持在0.020～0.037 mg·g-1。表2雙因素方差分析結(jié)果表明，水流交換率、富營養(yǎng)化應(yīng)用情境及兩者交互作用對羊棲菜類葉綠素a和胡蘿卜素濃度均無顯著性影響(P>0.05)。極度富營養(yǎng)化海水環(huán)境下可溶性蛋白濃度最高，養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下次之，近岸富營養(yǎng)化海水條件下最低。富營養(yǎng)化應(yīng)用情境對羊棲菜可溶性蛋白濃度有顯著性影響(P<0.05)?？扇苄蕴妓衔餄舛仍陴B(yǎng)蝦場廢水環(huán)境、水流交換率為50 vol·d-1時達到最大(26.460 ± 7.302) mg·g-1，在極端富營養(yǎng)化海水情境、水流交換率為100 vol·d-1時最小(5.549 ± 0.373) mg·g-1，與其他處理組的差異顯著(P<0.05)。如圖3所示，中濃度營養(yǎng)鹽即養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境條件下的Car/Chla比值明顯高于其他兩種應(yīng)用情景，且隨水流交換率的增加而增大。就SC/SP而言，近岸富營養(yǎng)化海水、養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下其比值明顯高于極端富營養(yǎng)化海水環(huán)境，富營養(yǎng)化應(yīng)用情境僅對SC/SP比值有顯著性影響(P<0.05)，而水流交換率及兩者交互作用對兩比值均無顯著性影響(P>0.05)。

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars with different lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).

表1 應(yīng)用情境，水流交換率及兩者的交互作用對羊棲菜和石莼比生長率影響的雙因素方差分析Table 1 ANOVA analysis of the effect of application scenarios， water exchange rate， and their interaction on specific growth rate (SGR) of Sargassum fusiforme and Ulva pertusa

圖4中石莼的葉綠素濃度和類胡蘿卜素濃度呈現(xiàn)出相同的趨勢，養(yǎng)蝦場廢水、極端富營養(yǎng)化海水環(huán)境下，兩物質(zhì)濃度均高于近岸富營養(yǎng)化海水環(huán)境下的兩者濃度，養(yǎng)蝦場廢水條件下兩物質(zhì)濃度均值分別為(1.089±0.083)mg·g-1、(0.319±0.007)mg·g-1，極端富營養(yǎng)化海水條件下兩物質(zhì)濃度均值分別為(1.082±0.015)mg·g-1、(0.454±0.004)mg·g-1?？扇苄缘鞍讋t呈現(xiàn)與前兩者相反規(guī)律，近岸富營養(yǎng)化海水、養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下其濃度高于極端富營養(yǎng)化海水環(huán)境，在養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境、水流交換率為25 vol·d-1條件下最高達(7.367±0.160)mg·g-1，養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境、水流交換率為0 vol·d-1條件下最低為(5.247±0.005)mg·g-1。而可溶性碳水化合物濃度在處理組中無明顯規(guī)律。表3顯示營養(yǎng)鹽濃度即海水富營養(yǎng)化應(yīng)用環(huán)境對4種物質(zhì)濃度均有顯著性影響(P<0.05)，而水流交換率及兩者交互作用對該4種物質(zhì)濃度均無顯著性影響(P>0.05)。圖3中極端富營養(yǎng)化海水環(huán)境下的石莼Car/Chl a和SC/SP比值最大，近岸富營養(yǎng)化海水環(huán)境下次之，養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下最小，且SC/SP比值在養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下隨水流交換率的增加而增大，且營養(yǎng)鹽濃度對兩類物質(zhì)比值均有顯著性影響(P<0.05)。

A， 葉綠素a濃度；B， 類胡蘿卜素濃度；C， 可溶性蛋白濃度；D， 可溶性碳水化合物濃度。A, Concentrations of Chlorophyll a; B, Concentrations of carotene; C, Concentrations of soluble protein; D, Concentrations of soluble carbohydrate.

表2 應(yīng)用情境，水流交換率及兩者交互作用對羊棲菜生化物質(zhì)影響的雙因素方差分析Table 2 ANOVA analysis of the effect of application scenarios， water exchange rate， and their interaction on biochemical compounds of Sargassum fusiforme

2.3 中試實驗

由圖5可知，隨著流速的增加，羊棲菜的比生長率分別增加80%、14%，石莼則增加41.3%、33.3%。中轉(zhuǎn)速條件下羊棲菜的生物量在前6 d增長緩慢，之后逐漸增加并于第10天達到最大值(6.30±0.29) g。水流交換速率對羊棲菜比生長率無顯著性影響(P>0.05)。三轉(zhuǎn)速條件下石莼生物量均生長良好，中轉(zhuǎn)速條件下生物量增長率最大，且從4 d開始生物量一直最大，高轉(zhuǎn)速條件下生物量增長次之。從兩者比生長率和生物量數(shù)據(jù)結(jié)合看來，石莼在每個轉(zhuǎn)速條件下的生長都優(yōu)于羊棲菜，甚至在高濃度條件下石莼的比生長率接近羊棲菜的2倍，但水流交換速率對石莼比生長率無顯著性影響(P>0.05)。

圖3 各應(yīng)用情境下羊棲菜和石莼中類胡蘿卜素與葉綠素a比值及可溶性碳水化合物與可溶性蛋白比值Fig.3 Ratios of carotene (Car) to chlorophyll a (Chla) and soluble carbohydrate (SC) to soluble protein (SP) in Sargassum fusiforme and Ulva pertusa under the application scenarios

圖4 各應(yīng)用情境下石莼生化物質(zhì)濃度Fig.4 Concentrations of biochemical compounds in Ulva pertusa under the application scenarios

表3 應(yīng)用情境(Ⅰ)，水流交換率(Ⅱ)及兩者交互作用(Ⅰ×Ⅱ)對石莼生化物質(zhì)影響的ANOVA分析Table 3 ANOVA analysis of the effect of application scenarios (Ⅰ)， water exchange rate (Ⅱ)， and their interaction (Ⅰ×Ⅱ) on biochemical compounds of Ulva pertusa

圖5 旋轉(zhuǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)示意圖及不同水流交換速度下羊棲菜和石莼的比生長率和生物量積累Fig.5 Schematic diagram of rotation cultivation system， SGR and biomass accumulation of Sargassum fusiforme and Ulva pertusa under different water exchange velocity

3 討論

羊棲菜比生長率受營養(yǎng)鹽影響顯著，在養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下表現(xiàn)出最大值，且隨著水流交換的增加而增大，與Koehl等[35]研究結(jié)果一致?？赡苁怯捎谒鹘粨Q率的增加可減少羊棲菜藻體表面的擴散邊界層厚度加快二氧化碳和營養(yǎng)鹽從介質(zhì)中向藻體表面的傳遞速率[21，23]，從而促進其藻體生長。在極度富營養(yǎng)化海水應(yīng)用情境中，羊棲菜藻體葉柄均出現(xiàn)發(fā)黑脫落現(xiàn)象，說明高濃度營養(yǎng)鹽超過羊棲菜需求的臨界值，較低的水流交換率可以緩解高濃度營養(yǎng)鹽的毒害作用，但生長明顯弱于另外兩情境下，過高的水流交換率所帶來的水流能量反而加速羊棲菜藻體的脫落[36-38]，降低其生長速率。

與羊棲菜相比，石莼在極端富營養(yǎng)化海水應(yīng)用情境中生長更好，由此表明石莼是海水富營養(yǎng)化修復(fù)的良好物種，這與程麗魏、徐永健等[36，39]的研究一致。石莼雖在極端富營養(yǎng)化海水環(huán)境下能保持較高的生長率比，但水流交換率達到200 vol·d-1時，藻體出現(xiàn)漂白現(xiàn)象，說明此條件已經(jīng)不利于石莼生長，導(dǎo)致藻體開始分解。石莼是一種組織C、N、P含量較小的海藻，藻體對C、N、P的貯存量比其他海藻低，因此推測當石莼快速吸收的營養(yǎng)鹽遠遠大于自身合成物質(zhì)和生長需要時，銨鹽在藻體內(nèi)過度累積造成NH3中毒，導(dǎo)致藻體漂白分解[11]。此外，石莼是由兩層細胞構(gòu)成的葉狀藻體，全部藻體細胞暴露在海水環(huán)境中[40]，水流交換率增大在增加營養(yǎng)鹽穩(wěn)定供給的同時卻減少葉面上的擴散邊界層，加快營養(yǎng)鹽從介質(zhì)中向藻體表面的傳送速率[41]，從而加速氨氮的吸收導(dǎo)致NH3中毒，藻體漂白分解。

藻體的光合作用是對外界氮、磷供給最敏感的反應(yīng)之一[42]。營養(yǎng)鹽供給的變化導(dǎo)致羊棲菜中葉綠素a和類胡蘿卜素含量略有波動，但無顯著差異，這與程麗巍[36]的研究一致。在養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下，Car/Chla比值達到最大，說明在此條件下光合色素中類胡蘿卜素發(fā)揮主要作用，吸收和傳遞光能，促進藻體生長。某些藻類中葉綠素a含量與營養(yǎng)鹽濃度的關(guān)系并不密切，而與其他環(huán)境因子如光照、溫度存在一定的相關(guān)關(guān)系[39，43]，但營養(yǎng)鹽濃度的增加可促進羊棲菜生長。因此，營養(yǎng)鹽濃度增加對羊棲菜生長的促進可能并不是通過影響光合色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)，而可能是通過影響其色素—蛋白質(zhì)復(fù)合物合成進而彌補光的吸收與傳遞[44]。高濃度營養(yǎng)鹽增加了羊棲菜藻體可溶性蛋白含量，但無法抵消高濃度營養(yǎng)鹽對藻體其他生理生化活動的毒害作用[37]。

石莼Chl a和Car含量隨營養(yǎng)鹽濃度和水流交換速率的增加呈上升趨勢，說明營養(yǎng)鹽供給可以促進石莼光合反應(yīng)中捕光色素類胡蘿卜素和葉綠素a含量來增強光合作用，促進藻體生長[39， 45-46]。在低、中濃度營養(yǎng)鹽即近岸富營養(yǎng)化海水、養(yǎng)蝦場廢水環(huán)境下，Car/Chla比值相對較低，說明石莼藻體主要合成葉綠素a來提高光合反應(yīng)，而在高濃度營養(yǎng)鹽即極度富營養(yǎng)化海水應(yīng)用情境下Car/Chla比值較高，反映了葉綠素a合成受阻，藻體則主要通過提高類胡蘿卜素含量來彌補藻體吸收光能[47]。SC/SP比值在極度富營養(yǎng)化海水應(yīng)用情境下達到最高，說明石莼藻體所產(chǎn)生的能量主要用于合成碳水化合物而非蛋白質(zhì)。而養(yǎng)蝦場廢水應(yīng)用情景下，石莼則會將更多能量用來合成蛋白質(zhì)，且水流交換率的增加可在一定程度上提高其合成速率與含量。碳水化合物含量在高濃度營養(yǎng)鹽下增長可能是與光合作用產(chǎn)物合成速率和消耗速率有關(guān)[48]，石莼藻體的光合作用產(chǎn)物合成速率大于其消耗速率，從而導(dǎo)致可溶性碳水化合物的積累[49]。

但中試實驗中，極端富營養(yǎng)化海水環(huán)境中藻體并未出現(xiàn)漂白現(xiàn)象。據(jù)此推測，水體與石莼的相對運動使由兩層細胞構(gòu)成的石莼藻體葉片大面積堆疊在一起，增加擴散邊界層，降低營養(yǎng)鹽從介質(zhì)中向藻體表面的傳送速率[41]，緩解NH3中毒。因此，自主設(shè)計的旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)能夠有效提高水流交換并減少過量營養(yǎng)鹽對藻體帶來的損害，而近年來人工上升流技術(shù)[50]的不斷發(fā)展使水流控制成為可能，這也暗示了研究優(yōu)化大型海藻養(yǎng)殖中水流交換的重要性。

謝辭：感謝浙江海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所林少珍工程師、張鵬研究員及洞頭基地相關(guān)工作人員在藻種和實驗場地、器材方面提供的幫助。