秦立鑫，張 琦

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

蜱屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、蛛形綱（Arachinda）、蜱螨目（Acarina）、蜱亞目（Ixodides）、蜱總科（Ixodoidae），主要分硬蜱科（Ixodidae）、軟蜱科（Argrasidae）、納蜱科（Nuttalliellidae）。

蜱是專性吸血的體表寄生蟲，嚴(yán)重?fù)p害動物的健康，被蜱叮咬，可造成中毒、咬傷、驚擾和失血。此外，蜱還是傳播多種疾病，如萊姆病、森林腦炎、斑點熱、野兔熱、Q熱、蜱出血熱等，嚴(yán)重時，可直接或間接造成家畜和人類的死亡。

萊姆?。↙yme disease）又稱為萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病，是一種經(jīng)由蜱傳播的自然疫源性人獸共患病，因首次在美國康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)因此而得名萊姆病。萊姆病主要因為蜱叮咬人、獸而傳染，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要臨床表現(xiàn)有皮膚慢性游走性紅斑、腦膜炎、顱神經(jīng)炎、神經(jīng)根炎、關(guān)節(jié)炎、心臟炎等癥狀。病原體為伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi），可分為13個基因型。1982年，Willy等在美國首次從肩突硬蜱中分離出伯氏疏螺旋體，我國于1986年首次發(fā)現(xiàn)該病在位于黑龍江省海林縣林區(qū)，之后相繼報道的病原有狹義伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi sensus stricto）、伽氏疏螺旋體（B.garinii）、阿氏疏螺旋體（B.afzelii）和法雷斯疏螺旋體（Borrelia valaisiana）共4個基因型。目前，我國至少存在6種不同基因型，包括阿氏疏螺旋體（B.afzelii）、伽氏疏螺旋體（B.garinii）、伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi sens utricto）、法雷斯疏螺旋體（B.valaisiana）、西尼伽疏螺旋體（B.sinica）和長江疏螺旋體（B.yangtze）[1]。其中阿氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體屬于致病基因型。

該病呈現(xiàn)世界性分布，亞洲、歐洲、美洲、大洋洲、非洲的70多個已國家報道有該病發(fā)生，且發(fā)病區(qū)域在不斷擴(kuò)大，發(fā)病率呈上升趨勢[1]。我國29個省（區(qū)、市）均有人患萊姆病的報道，而且每年新發(fā)病例高達(dá)上萬余例。蜱是伯氏疏螺旋體的傳播媒介和貯存宿主，蜱通過叮咬吸血將病原體傳遞給人類及動物。我國地域遼闊，蜱的種類繁多，并且因為環(huán)境等各方面因素不同，感染伯氏疏螺旋體情況也存在著較大的差異，因此探明蜱的種類在該病的防治中具有重要意義。

黑龍江省海倫市一廠二礦及星火牧場有著良好的生態(tài)環(huán)境，是重要的養(yǎng)殖園區(qū)。并且在此有被蜱叮咬的記錄，因此了解蜱感染伯氏疏螺旋體的情況，為萊姆病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 采集樣本

在黑龍江省海倫市一廠二礦及星火牧場周圍采用布旗法采集游離蜱，鑒定分類后低溫保存。

1.1.2 引物制備和方法

本試驗采用嵌套PCR的方法檢測伯氏疏螺旋體。需進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。

第一輪擴(kuò)增時使用的引物：23S N1和C1，擴(kuò)增條件：94℃30 s，52℃30 s，72℃60 s，30個循環(huán)。

23S N1：5'-ACC ATA GAC TCT TAT TAC TTT GAC-3'

C1：5'-TAA GCT GAC TAA TAC TAA TTA CCC-3'

第二輪擴(kuò)增時使用的引物：23S N2和5S CB，擴(kuò)增條件：94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，40個循環(huán)。

23S N2：5'-ACC ATA TCT TAT TAC TTT GAC CA-3'

5S CB：5'-GAG AGT AGG TTA TTG CCA GGG-3'

1.1.3 試驗試劑

DNA 2 000 Marker、DNA聚合酶、引物、超純水、TAE、EB、瓊脂糖、dNTPs等。

1.1.4 主要儀器

振蕩器；電泳槽（北京君意東方制造）；Hws24水浴鍋（上海恒科儀器制造）；高速臺式離心機(jī)；PCR儀（TaKaRa）；小型離心機(jī)（江蘇海林市其林貝爾儀器制造）；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)；電泳儀（六一牌）；微波爐（美的牌）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

DNA提取具體方法如下。

將蜱放入研缽內(nèi)（研缽在每次使用時須確保以充分洗凈，以防所提取的DNA被殘留的DNA污染），然后小心的倒入液氮，充分研磨至無較大的碎片為止。

加入450 μL裂解液至研缽內(nèi)與磨碎的蜱充分進(jìn)行混合，用移液槍轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。

向離心管內(nèi)加入20 μL蛋白酶K。加蛋白酶K時需要將槍頭深入離心管中，充分混合均勻后，封口，將離心管置于56℃的水浴鍋中過夜消化。

加450 μL苯酚（Tris平衡酚），注意苯酚分上下兩層，吸下層（先將槍頭插入再打氣），簡短搖晃20下，12 000 r·min-1離心10 min。

吸上層到新管，加225 μL氯仿及225 μL苯酚，搖晃20次，12 000 r·min-1離心10 min。

吸上層到新管，加450 μL氯仿。搖晃20次，12 000 r·min-1離心10 min。

吸上層到新管，加滿無水乙醇（低溫），-20℃冰箱保存20 h。

離心機(jī)預(yù)冷，12 000 r·min-1離心16 min，注意離心管放置角度一致。

將液體倒入新管中備用或棄掉，再將所得沉淀（DNA）?？墼诟蓛舻募埥砩?，5 min晾干。

加入1 000 μL 80%酒精清洗，洗脫鹽離子，震蕩，混勻。

12 000 r·min-1離心5 min。重復(fù)沉淀及晾干。加入100 μL TE，室溫環(huán)境放置約30 min，混勻。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系（25 μL體系）

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

取0.8 g瓊脂糖放入錐形瓶中，后加入90 mL TAE，用微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，冷卻至不感覺燙手時，再加入EB并充分的混和均勻，倒入準(zhǔn)備好的板中，待膠凝好后，即可進(jìn)行下一步操作。

取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入點樣孔中（勿點破凝膠），凝膠板中間的點樣孔中加入Mark以作參照。

點完樣之后，蓋上電板蓋并打開電泳儀，運(yùn)行17 min（電泳條帶跑至4～5線間）即可停止，進(jìn)行照膠和記錄數(shù)據(jù)。

2 試驗結(jié)果

2.1 基因的擴(kuò)增

以蜱DNA為模板，用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后所得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見226～266 bp的條帶（圖1、圖2），與預(yù)期相符。

通過PCR的結(jié)果對黑龍江省海倫市一廠二礦及星火牧場的革蜱攜帶伯氏疏螺旋體情況進(jìn)行統(tǒng)計，如表2所示，總檢出率為53.13%。其中一廠二礦的檢出率最高為64.58%；星火牧場的檢出率為41.67%。

2.2 基因測序

將伯氏疏螺旋體陽性樣本從中挑選9份送去DNA測序，部分測序結(jié)果見圖3～6。

圖3中108號革蜱伯氏疏螺旋體的基因序列經(jīng)測序分析大小為229 bp，BLAST比對結(jié)果顯示該蜱感染的伯氏疏螺旋體基因型與B.garinii基因型相識度為86%（圖4）。

圖1 一廠二礦革蜱的伯氏疏螺旋體部分檢測結(jié)果

圖2 星火牧場革蜱的伯氏疏螺旋體部分檢測結(jié)果

表2 革蜱伯氏疏螺旋體的感染情況

圖3 108號革蜱伯氏疏螺旋體的基因序列結(jié)果

圖4 108號革蜱的BLAST對比結(jié)果

圖5中142號革蜱伯氏疏螺旋體的基因序列經(jīng)測序分析大小為225 bp，BLAST比對結(jié)果顯示該蜱感染的伯氏疏螺旋體基因型與B.afzelii基因型相似度為99%（圖6）。測序結(jié)果顯示一廠二礦及星火牧場的革蜱均有感染阿氏和伽氏兩種伯氏疏螺旋體基因型的情況，BLAST對比結(jié)果見表3。

圖5 142號革蜱伯氏疏螺旋體的基因測序結(jié)果

圖6 142號革蜱的BLAST對比結(jié)果

地點星火牧場一廠二礦伽氏疏螺旋體145 108、174、187阿氏疏螺旋體122、134、142、158 116

2.3 構(gòu)建進(jìn)化樹

構(gòu)以測序獲得的伯氏疏螺旋體序列及GenBank上登錄的相關(guān)伯氏疏螺旋與B.afzelii在同一進(jìn)化分支上。表明這兩個地點革蜱均攜帶了B.garinii和B.afzelii兩種伯氏疏螺旋體，且攜帶率較高。如圖7所示。

圖7 進(jìn)化結(jié)果

3 討論

本次試驗的96份樣品中檢測到51份含有伯氏疏螺旋體，總檢出率為53.13%。檢出率較高。這次試驗表明一廠二礦及星火牧場的革蜱攜帶伯氏疏螺旋體，其中一廠二礦的革蜱攜帶率最高，其次是星火牧場。

早在1986年，在我國黑龍江省海林縣林區(qū)便首次報道了萊姆病感染情況，并從中分離出伯氏疏螺旋體。在那之后，我國30多個省（直轄市、自治區(qū)）均有該病的報道出現(xiàn)，現(xiàn)已證實其中有19個存在萊姆病的自然疫源地。這一結(jié)果為該地區(qū)萊姆病的診斷防治提供了一定的依據(jù)，可以據(jù)此來幫助臨床診斷。現(xiàn)已查明有多種野生動物、鳥類及家畜（牛、馬、犬等）可以作為本病的宿主，維持該病在自然界中的存在和持續(xù)循環(huán)[1]。嚙齒類動物是萊姆病的主要傳染源，因其分布廣、數(shù)量多、感染普遍。另外，鳥類的遷徙為遠(yuǎn)距離傳播伯氏疏螺旋體創(chuàng)造了條件。因此，了解區(qū)域內(nèi)伯氏疏螺旋體的感染情況，檢測其宿主動物的帶菌率是十分必要。對萊姆病傳播媒介和儲存宿主的控制有助于防控該病在我國的流行[2]。

生活在萊姆病自然疫源地及蜱蟲存在地區(qū)的人有感染該病潛在可能。發(fā)病高峰期主要在夏末秋初。但是，由于地區(qū)之間存在著氣候差異，因此不同地區(qū)萊姆病流行的時間也存在一定的差異。

試驗結(jié)果表明，兩地點革蜱感染伯氏疏螺旋體阿氏和伽氏兩種基因型，這兩種基因型均屬于致病型。因此生活在牧場、林區(qū)及植被豐富地區(qū)的人應(yīng)注意對萊姆病的預(yù)防，如被蜱叮咬且出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)及皮膚病變者，應(yīng)將萊姆病列入排查范圍,以防漏診、誤診。因此，場區(qū)應(yīng)做好防控工作以保護(hù)工作人員和畜禽的安全，應(yīng)采取一定的措施以防感染，注意定期殺蟲。目前對萊姆病及其他蜱傳播的疾病的主要預(yù)防措施是定期殺蟲，主要運(yùn)用殺蟲劑來控制蜱的數(shù)量，但是這種方法會造成環(huán)境污染且容易出現(xiàn)抗藥性，同時對人和動物存在一定的危險。目前有效的措施既殺蟲劑的使用，有針對性的干預(yù)和個人的防護(hù)等措施相互結(jié)合起來，預(yù)防萊姆病和其他蜱傳播的疾病。

本次試驗為今后對其他地區(qū)伯氏疏螺旋體的研究，積累了寶貴的經(jīng)驗。

4 結(jié)論

海倫市一廠二礦及星火牧場部分地區(qū)存在革蜱感染伯氏疏螺旋體的情況，并且感染率較高，感染基因型均屬于致病型，應(yīng)注意防范。