袁向飛，田文聰，謝俊木子，王 豐

作為一種過繼免疫療法，CD19嵌合抗原受體T細胞 CAR-T (chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）在治療B淋巴細胞白血病方面取得了舉世矚目的成功，被認為是CAR-T治療技術(shù)的里程碑；由此，CAR-T在治療實體腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用也成為了新近的腫瘤免疫治療研究的熱點[1]。Katz等[2-4]利用以癌胚抗原為靶點的CAR-T（CEA CAR-T）開展了一系列針對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移的臨床前研究工作，特別是對于肝轉(zhuǎn)移的治療已經(jīng)進入臨床Ⅰ期試驗階段；然而，他們也同時指出腫瘤固有的免疫抑制微環(huán)境是限制CAR-T療效的重要原因之一。

實體腫瘤的免疫抑制微環(huán)境與其瘤內(nèi)的低氧狀態(tài)密切相關(guān)，許多研究業(yè)已證實：在低氧環(huán)境中，腫瘤細胞往往會上調(diào)諸多免疫抑制分子,比如程序性死亡受體-配體1(PD-L1)[5-6]、半乳糖凝集素-1(galectin-1)[7]、環(huán)氧合酶 -2（COX-2）[8]和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[9]等。而低氧誘導因子-1（HIF-1）作為低氧環(huán)境的重要響應(yīng)元件，直接調(diào)控著上述免疫抑制分子的轉(zhuǎn)錄。

大黃酸又名1,8-二羥基-3-羧基蒽醌，是中藥大黃的主要有效成分之一。在我們的前期研究工作中發(fā)現(xiàn)大黃酸能夠下調(diào)胰腺癌細胞中HIF-1α（HIF-1的亞基）的水平，從而降低其下游分子的表達水平[10]。據(jù)此我們認為：在低氧環(huán)境下，大黃酸能夠通過降低結(jié)腸癌中HIF-1α的水平致使其免疫抑制分子的表達下調(diào)，從而有助于效應(yīng)T細胞對腫瘤細胞的殺傷。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞系HT29和HCT116，以及人胚腎來源的細胞系293 T用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。低氧條件培養(yǎng)在低氧罐進行，步驟如下[11-12]：用N2(95%) 和CO2(5%)的混合氣體充滿罐體，待罐內(nèi)O2水平降為1%時，密封并置于37 ℃。常氧條件培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)進行。

將健康成人志愿者的外周血用淋巴細胞分離液（Ficoll）分離出單個核細胞。分離出的細胞用含10%FBS和100 U/mL重組人白介素-2的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液一次。

1.2 細胞生存率實驗 各細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板，經(jīng)不同濃度的大黃酸處理48 h后，用CCK-8試劑檢測細胞的生存率。實驗重復3次，每次設(shè)3個平行復孔。

1.3 實時定量PCR（qPCR） 收集不同處理后的細胞，加入Trizol試劑，提取總RNA。將4 μg總RNA用SuperScript? First-Strand Synthesis System逆 轉(zhuǎn) 錄 成 cDNA。 用 SYBR?Premix Ex Taq?kit進行PCR，步驟如下：95℃變性5 s；60 ℃退火34 s；40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參基因。各基因引物序列見表1。結(jié)果用ΔΔCt法分析，實驗重復3次，每次設(shè)3個平行復孔。

1.4 外周血淋巴細胞（PBL）特異識別細胞系的建立 mCD3scfv的序列由中國醫(yī)學科學院血液學研究所熊冬生教授饋贈，該序列包括信號肽、HA標簽、柔性肽鏈、CD3抗體輕鏈可變區(qū)、CD3抗體重鏈可變區(qū)和血小板衍生生長因子受體跨膜區(qū)等序列元件（圖1）。

將mCD3scfv序列通過EcoR I和BamH I限制性酶切位點插入慢病毒質(zhì)粒pCDH1-CMV-MSCEF1-Puro后，與慢病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝慢病毒，方法見參考文獻[13]。用該慢病毒感染HT29細胞48 h后，加30 μg/mL的嘌呤霉素連續(xù)篩選2周。最終獲得穩(wěn)定表達mCD3scfv的HT29細胞系，命名為HT29-CD3scfv。

圖1 mCD3scfv編碼序列結(jié)構(gòu)示意圖

1.5 Western blot 用細胞裂解液RIPA裂解細胞后，將蛋白行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用5%脫脂奶4 ℃封閉過夜，加一抗室溫孵育1 h，用TBS-T清洗3遍后，再加HRP標記的二抗室溫孵育1 h，再用TBS-T清洗3遍后，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的蛋白條帶。β-tubulin為內(nèi)參對照。

1.6 流式細胞術(shù)與免疫熒光 細胞用PBS清洗2遍后，與APC標記的抗HA-Tag單抗共孵育30 min，用流式細胞儀進行檢測。將細胞用甩片機甩至玻片，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用1%BSA封閉1 h。用APC標記的抗HA-Tag單抗孵育1 h后，再用DAPI染核5 min，隨后用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.7 PBL的細胞毒性檢測 將PBL與腫瘤細胞按不同效靶比（E:T）混合培養(yǎng)16 h后，用CytoTox96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit檢測腫瘤細胞被殺傷的百分率，具體方法參照試劑盒說明。實驗重復3次，每次設(shè)3個平行復孔。1.8 統(tǒng)計方法 應(yīng)用EXCEL軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)為計量資料，以均數(shù)±標準差（）表示。多組間均數(shù)采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用Dunnettt檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸對結(jié)腸癌細胞系和人PBL的細胞毒性 CCK-8檢測結(jié)果顯示（圖2）：大黃酸對人結(jié)腸癌細胞系HT29和HCT116的細胞生存率都有抑制效果。本研究著重關(guān)注大黃酸對免疫抑制分子的調(diào)節(jié)功能，故而選擇對結(jié)腸癌細胞生存影響非常小的兩個濃度（25 μM和50 μM）作為后續(xù)工作的研究劑量。此外，在此兩個濃度的大黃酸作用下，PBL的細胞生存率并沒有受到明顯抑制。這提示我們可以將低濃度的大黃酸與PBL聯(lián)合用于抗結(jié)腸癌的研究。

圖2 CCK-8檢測大黃酸對結(jié)腸癌細胞系和PBL的細胞毒性

2.2 大黃酸在低氧條件下下調(diào)HIF-1α和免疫抑制分子PD-L1和galectin-1 HT29細胞分別在常氧、低氧、低氧+25 μM大黃酸和低氧+50 μM大黃酸條件下處理16 h后，用Western blot和qPCR檢測細胞中HIF-1α的水平以及PD-L1和galectin-1的轉(zhuǎn)錄水平。Western blot結(jié)果顯示（圖3A）：低氧條件使HIF-1α的水平較明顯升高；而在低氧條件下加入25 μM或者50 μM大黃酸后，細胞中HIF-1α的水平顯著降低；特別是加入50 μM大黃酸后，細胞HIF-1α水平甚至低于常氧培養(yǎng)組。PD-L1和galectin-1是腫瘤細胞表面表達的能夠直接誘導效應(yīng)T細胞發(fā)生凋亡的免疫抑制分子。用qPCR檢測上述各處理組細胞中PD-L1和galectin-1的mRNA，結(jié)果與HIF-1α水平的變化趨勢相似（圖3B）：與常氧對照組相比，低氧組、低氧+25 μM大黃酸組和低氧+50 μM大黃酸組細胞中PD-L1 mRNA的相對量分別為 1.63±0.29、0.80±0.17和0.47±0.12；galectin-1mRNA的相對量分別為4.42±0.73、0.47±0.11和0.24±0.11。低氧使它們轉(zhuǎn)錄增多；在低氧條件下加入大黃酸后，它們的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，但大黃酸兩個濃度處理組之間沒有顯著性差異（a代表P＜0.05;b代表P＜0.01）。提示大黃酸可以阻斷由低氧引起的PD-L1和galectin-1表達增高所導致的效應(yīng)T細胞凋亡。

圖3 Western blot和qPCR檢測大黃酸對HIF-1α、PD-L1和galectin-1的抑制作用

2.3 PBL特異識別的結(jié)腸癌細胞系的建立和鑒定 為了驗證大黃酸能夠增強效應(yīng)T細胞的腫瘤殺傷能力，我們建立了一株能夠被PBL特異識別并殺傷的結(jié)腸癌細胞系HT29-CD3scfv。該細胞系是通過慢病毒感染HT29細胞，并經(jīng)過嘌呤霉素篩選出的能夠穩(wěn)定表達膜結(jié)合型抗CD3單鏈抗體（mCD3scfv）的細胞系，它可以通過膜表面的單鏈抗體與淋巴細胞表面的CD3結(jié)合，從而激活T淋巴細胞，實現(xiàn)特異的識別和殺傷。

首先，利用mCD3scfv中的HA標簽鑒定該融合蛋白在HT29-CD3scfv中的表達和定位，以HT29-control細胞為對照。Western blot結(jié)果顯示 HT29-CD3scfv成功表達mCD3scfv蛋白（圖4A）。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示mCD3scfv定位在細胞膜（紅色，藍色為細胞核，圖4B）。然后，依然用APC標記的抗HA標簽抗體標記細胞，做流式細胞術(shù)分析，結(jié)果顯示HT29-CD3scfv中表達融合蛋白的細胞比例為96.8%，而HT29-control細胞的陽性率只有0.2%（圖4C）。最后，將PBL分別與HT29-CD3scfv或者HT29-control按不同效靶比（5:1～20:1）混合培養(yǎng)16 h后，用CytoTox96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit檢測腫瘤細胞死亡率。結(jié)果顯示（圖4D）：PBL對HT29-CD3scfv有顯著殺傷，并且隨著效靶比的增加，殺傷效率也升高；而對HT29-control，PBL在不同效靶比下的殺傷效率都非常低。說明PBL對HT29-CD3scfv能夠特異性識別并殺傷。

圖4 HT29-CD3scfv細胞的鑒定

2.4 大黃酸逆轉(zhuǎn)由低氧造成的PBL對結(jié)腸癌細胞殺傷能力降低 對HT29-CD3scfv細胞分別進行3種不同處理：（1）常氧培養(yǎng)8 h后，按不同效靶比加入PBL，繼續(xù)常氧培養(yǎng)16 h；（2）低氧培養(yǎng)8 h后，按不同效靶比加入PBL，繼續(xù)低氧培養(yǎng)16 h；（3）加50 μM大黃酸低氧培養(yǎng)8 h，按不同效靶比加入PBL，繼續(xù)低氧培養(yǎng)16 h（含50 μM大黃酸）。用 CytoTox96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit檢測腫瘤細胞死亡率。結(jié)果顯示：當效靶比為1：1、2：1和4：1時，T細胞對腫瘤細胞的殺傷百分率分別為（27.32±3.05）%、（42.68±3.69）%和（54.02±1.82）%；而 低 氧 條 件 下， PBL的殺傷能力分別下降至（21.53±3.74）%、（33.55±1.51）%和（45.20±2.27）%，與相應(yīng)的常氧條件培養(yǎng)組相比有顯著性差異；在低氧條件下加入50 μM大黃酸，殺傷百分率又分別被恢復升高至（32.70±2.37）%、（47.01±3.15）%和（57.26±1.12）%，與相應(yīng)的單純低氧條件培養(yǎng)組相比存在統(tǒng)計學差異（圖5，a代表P＜0.05;b代表P＜0.01）。

圖5 PBL在不同條件下對腫瘤細胞的殺傷能力

3 討論

諸多研究結(jié)果已經(jīng)表明：實體瘤內(nèi)的低氧狀態(tài)與其免疫抑制微環(huán)境密切相關(guān)，而免疫抑制微環(huán)境又是T細胞免疫治療實體瘤的巨大障礙[14-15]。在低氧的環(huán)境中干擾腫瘤細胞中HIF-1α的表達可以提高T細胞對其的殺傷能力[5]。鑒于在早先研究工作中我們發(fā)現(xiàn)中藥有效成分大黃酸能夠使胰腺癌細胞在低氧條件下的HIF-1α水平下降[10]，故而我們推測大黃酸有望增強T細胞在低氧時抗腫瘤活性。

在本研究工作中，我們以結(jié)腸癌細胞為實驗對象，首先確定了大黃酸在體外實驗研究中的使用濃度（25 μ M和50 μM）。在上述濃度作用下，胰腺癌細胞系和PBL的生長都沒有受到顯著影響。隨后又驗證了在這兩個濃度的大黃酸作用下，結(jié)腸癌細胞系中由低氧條件引起的HIF-1α水平升高被逆轉(zhuǎn)。進而，我們又以兩個明確受HIF-1α調(diào)控的免疫抑制分子（PD-L1和galectin-1，二者可以直接引起T細胞凋亡）為檢測指標[5,9]。在低氧條件下，上述兩個分子的轉(zhuǎn)錄水平均有升高；而在加入大黃酸之后，其轉(zhuǎn)錄水平被顯著下調(diào)。為了能夠在體外驗證大黃酸對低氧條件下T細胞抗腫瘤活性的影響，我們建立了能夠被PBL特異識別殺傷的結(jié)腸癌細胞系。最后在此細胞系上，我們驗證了大黃酸可以逆轉(zhuǎn)低氧造成的PBL殺傷腫瘤活力下降。這些結(jié)果預(yù)示了大黃酸與免疫細胞療法聯(lián)合使用可以增強免疫細胞抗腫瘤活力的可能性。

在現(xiàn)有的工作基礎(chǔ)之上，還有更多的研究內(nèi)容亟待我們?nèi)ヌ剿鳌＃?）雖然我們發(fā)現(xiàn)大黃酸對PBL的生長沒有產(chǎn)生影響，但是它對PBL其它功能的影響還需要進一步的了解。實際上HIF-1α對T淋巴細胞的作用目前仍存在爭議：一部分人認為在腫瘤內(nèi)的T細胞需要HIF-1α的水平升高來提供能量[16-17]；另一部分人則證明了抑制HIF-1α能夠促進T細胞分化為記憶性T細胞，甚至增強瘤苗的療效[18-20]。（2）腫瘤的免疫抑制微環(huán)境構(gòu)成復雜，包括免疫抑制分子和免疫抑制細胞。實際上，除了PD-L1和galectin-1之外，我們還檢測了其它免疫抑制分子（比如COX-2、VEGF等）在大黃酸作用下的轉(zhuǎn)錄水平變化，其趨勢均與PD-L1和galectin-1非常類似。而免疫抑制細胞諸如TAM、MDSC、Treg等是免疫抑制微環(huán)境的重要組分，它們的免疫抑制功能在很大程度上依賴于各種免疫抑制分子和HIF-1[21-23]。因此，在動物體內(nèi)研究大黃酸對各種免疫抑制細胞比例的調(diào)控作用將是下一步工作的重點。