廣西欽州海鴨蛋中多環(huán)芳烴含量的測定

□ 李 薇 熊子成 馮曉斌 欽州市食品藥品監(jiān)督管理局 黃 嫻 防城港市技術(shù)監(jiān)測所 譚 晶 欽州學(xué)院

海灘養(yǎng)殖的海鴨通常以退潮后滯留在灘涂上的魚、蝦、蜆、蟹等水生動(dòng)物為飼料，生長發(fā)育快，海鴨蛋產(chǎn)蛋率高。海鴨蛋擁有豐富的蝦青素、卵磷脂、蛋白質(zhì)等對人體有益的物質(zhì)，是一種天然的保健品。蝦青素是類胡蘿卜素的一種，具有很強(qiáng)大的保健功效，可加強(qiáng)人體抵抗衰老的能力。卵磷脂能夠保護(hù)肝臟、延緩衰老、預(yù)防肝硬化和老年癡呆、增強(qiáng)記憶力等。海鴨蛋中富含的蛋白質(zhì)多種多樣，是構(gòu)成人體的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于提高人體免疫力。另外，海鴨蛋中還富含人體必需的18種氨基酸以及鈣、鐵、鋅、碘、鉀、硒等多種對人體有好處的微量元素和維生素A、B、E等數(shù)十種維生素。廣西欽州海鴨蛋具有體積較大、蛋殼堅(jiān)厚、蛋清濃稠，蛋黃比例大、色澤呈橙色、無腥味等特點(diǎn)，已經(jīng)成為廣西農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品。

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs ）是一類含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)結(jié)構(gòu)的持久性有機(jī)物，具有持久性、長距離遷移性、親脂性和“三致”（致癌、致畸和致突變)）毒性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸PAHs可造成孕婦較高流產(chǎn)率，并可通過母體對嬰兒的生長產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致幼兒患病危險(xiǎn)性增加。毒理學(xué)研究表明，PAHs高暴露可誘發(fā)人體肝癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、膀胱癌等，而長期呼吸含PAHs的空氣，飲用或食用含有PAHs的水和食物，則會(huì)造成慢性中毒[3]。多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境和食品污染物，它們常常源自于環(huán)境，會(huì)通過大氣、土壤和地面水等介質(zhì)轉(zhuǎn)移至水生生物有機(jī)體內(nèi)，生物體吸收后無法進(jìn)行有效的代謝，這將影響到水中生物的生長，使得生物體內(nèi)蓄積不同程度的多環(huán)芳烴污染物[4-6]。美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）于20世紀(jì)80年代就將16種多環(huán)芳烴列入優(yōu)先控制的有毒有機(jī)污染物名單中，但未對該16種多環(huán)芳烴的具體限量值作出明確規(guī)定[7]。據(jù)估計(jì)，當(dāng)累計(jì)攝入PAHs量超過80mg時(shí)，即可誘發(fā)癌癥，聯(lián)合國農(nóng)糧組織（FAO/WHO）對食品中的PAHs類物質(zhì)每天攝入的總量建議不超過10μg為宜[8-9]。

目前，多環(huán)芳烴的測定方法較多[10-18]，但國內(nèi)外針對海鴨蛋中多環(huán)芳烴的研究極少，更多的是研究海鴨蛋的營養(yǎng)價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)效益[19-20]。根據(jù)食物鏈生物富集的特點(diǎn)，海鴨攝取海灘上滯留的受多環(huán)芳烴污染的小魚、小蝦、小蟹、小螺等水中生物后孵下海鴨蛋，人們食用海鴨蛋隨著攝入量的增加，多環(huán)芳烴在人體內(nèi)不斷富集，其在人體內(nèi)的濃度必定會(huì)逐漸增加，長此以往必定會(huì)對人體產(chǎn)生不同程度的危害。本文以犀牛角鎮(zhèn)海鴨蛋和種類繁多的欽州城東市場的海鴨蛋為研究對象，采用色譜法進(jìn)行前處理和儀器分析，研究其中PAHs的含量，為海鴨蛋食用價(jià)值的開發(fā)與利用提供依據(jù)，對海鴨蛋中多環(huán)芳烴的的檢測具有重要的意義，也為同類物質(zhì)中多環(huán)芳烴的檢測提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

GCMS-QP2010Ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；LP Vortex Mixer渦旋振蕩器；DS-7510TDH 超聲波清洗器；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋；ATY124 電子天平；13種PAH標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99%，美國accustandard公司）)，包括萘（Nap）、苊烯（Acel）、苊（Ace）、菲（Phe）、 蒽（An）、 芘（Py）、?（Chry）、苯并［a］蒽（BaA）、苯并［b］熒蒽（BbF）、苯并［k］熒蒽（BkF）、苯并［a］芘（BaP）、二苯并［a，h］蒽（DahA）、苯并［g，h，i］苝（BghiP）。其他有機(jī)試劑均為色譜純級別。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1000μg/mL，使用時(shí)用正己烷稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的采集

在欽州城東市場及犀牛角鎮(zhèn)一帶養(yǎng)殖戶隨機(jī)選取大小相近的海鴨蛋作為實(shí)驗(yàn)對象。用蒸餾水洗凈蛋殼表面，晾干，把海鴨蛋分成蛋殼蛋白蛋黃三部分，置于干凈燒杯中。

表1 13種多環(huán)芳烴的回歸方程及相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.2 樣品中多環(huán)芳烴的提取

分別稱取5.0g海鴨蛋的蛋殼、蛋白、蛋黃于小燒杯中，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，以少量的甲醇沖洗小燒杯內(nèi)壁，并將沖洗液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶。采用蛇形冷凝管安裝回流冷凝裝置。再往圓底燒瓶中加入25mL的甲醇和10mL的25%的氫氧化鉀溶液，利用回流冷凝裝置在80℃水浴鍋中浸提60min。浸提結(jié)束，再以2～3mL環(huán)己烷潤洗蛇形冷凝管內(nèi)壁，使得環(huán)己烷流入圓底燒瓶中，取出，待冷卻至室溫。加入30mL環(huán)己烷，振蕩1 min。放入超聲波清洗器中，設(shè)置溫度為20℃，超聲提取1 h。取出圓底燒瓶，待冷卻至常溫，用漏斗過濾至分液漏斗中。充分振搖分液漏斗，靜置，直到出現(xiàn)明顯分層，將下層水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)分液漏斗中并加入10mL環(huán)己烷，振搖數(shù)十下，待到分層，再棄下層水相，合并上層環(huán)己烷。加入10.0g無水硫酸鈉，振搖，放置3～4h使其充分脫水，再過濾至旋蒸瓶中。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在水浴溫度為40℃的條件下濃縮提取物至體積約1mL。用吸管吸取提取液轉(zhuǎn)移至硅膠固相萃取柱，進(jìn)行凈化。

2.3 樣品中多環(huán)芳烴的凈化

稱取10.0 g的有活性的二氧化硅，加入適量的環(huán)己烷使其濕潤，轉(zhuǎn)移至填充柱。用30 mL環(huán)己烷洗滌柱子，以燒杯收集洗滌液。吸取洗滌液重復(fù)沖洗填充柱內(nèi)壁上的二氧化硅使其沉降，使環(huán)己烷液面略高于填充柱內(nèi)填充物的高度。完成二氧化硅凝膠柱的制備后，將濃縮好的提取物轉(zhuǎn)移至柱子中，以8 mL體積的環(huán)己烷：二氯甲烷=3∶1的混合溶液沖洗柱子，進(jìn)行洗脫。收集得到經(jīng)凈化的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，加入少量正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至25mL的棕色容量瓶中，以正己烷定容，待GC/MS分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

圖1 13種PAHs的質(zhì)譜圖

濃度為10.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取13種標(biāo)準(zhǔn)品適量，用正己烷溶解并稀釋至刻度線得到單標(biāo)儲(chǔ)備液。量取適量各單標(biāo)儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，以正己烷定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中各PAH 濃度均為10.0 μg/mL，置于冰箱4 ℃保存。

分別取0.0 、0.25、0.5、1.0、2.0mL的濃度為10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于不同的25mL容量瓶中，以正己烷定容得濃度為0.0、0.1、0.2 、0.4 、0.8 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 儀器工作條件

色譜柱：DB- 5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；溫度（程序升溫）：初溫60 ℃，保持1min，升溫速度20 ℃/min，至220 ℃，保持1min，升溫速度5 ℃/min，至280 ℃，保持10min。

進(jìn)樣：不分流進(jìn)樣1.0 μl。接口溫度：300 ℃。載氣：氦氣。流速：1.0mL/min。掃描方式：SIM掃描。電子能量：70eV。離子源：EI源。離子源溫度 ：230 ℃。劑延遲時(shí)間：5min。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)溶液為母液制備濃度為0.0、0.1、0.2、0.4、0.8μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測定，得到13種PAHs的質(zhì)譜圖，各化合物色譜圖如圖1所示。各多環(huán)芳烴回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)見表1，多環(huán)芳烴在0～0.8μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.991～0.999，方法檢出限在2.50～12.15ng/L。

3.2 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取0.1mL（添加濃度為0.2μg/g）10.0μg/mL的13種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按（2.2-2.3）步驟操作及相同條件（2.5）下測定，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

樣品加標(biāo)回收：準(zhǔn)確稱取5.0g的3份樣品，采用添加標(biāo)準(zhǔn)樣法測定回收率，對樣品提取前加入10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)體積為分別為0.1mL（添加濃度為0.2μg/g），按（2.2-2.3）步驟操作及相同條件（2.5）下測定，測定3次。對照組就是未添加標(biāo)準(zhǔn)物的樣品，根據(jù)加標(biāo)的量與對照組的檢出量計(jì)算回收率。計(jì)算公式：回收率=（加標(biāo)測得量-樣品原有值）/加入量×100%。結(jié)果:13種多環(huán)芳烴的空白加標(biāo)回收率為91.5%～101.3%，樣品加標(biāo)回收率為90.2%～102.4%。空白、樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該方法下PAHs回收率良好，均達(dá)到要求。

表2 空白、樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 海鴨蛋中13種PAH的含量圖

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精確量取10.0μg/mL混合對照品溶液配制成1μg/L混合標(biāo)液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量為1μL，計(jì)算各峰面積的RSD值，結(jié)果見表3。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果知道各PAHs的精密度RSD為1.9%～5.7%，表明該方法下儀器的精密度好。

3.4 海鴨蛋中PAHs的含量

根據(jù)2.2-2.3實(shí)驗(yàn)得到的樣品進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用儀測定，得到各樣品的PAHs含量結(jié)果見表4，各PAHs含量如圖2所示。

由海鴨蛋中PAHs含量的測定結(jié)果可以看出，城東市場這組的海鴨蛋中PAHs總含量較低，為0.42μg/g，平均值為0.032μg/g。各PAH的總含量范圍為0.010～0.090μg/g，最小值為菲、蒽、芘、苯并[g,h,i]苝，最大值為苯并［a］蒽。犀牛角鎮(zhèn)組的海鴨蛋中PAHs總含量較高，為0.995μg/g，平均值為0.077μg/g。各PAH的總含量范圍在0.015～0.155μg/g，最小值為蒽，最大值為?。除了海鴨蛋蛋殼樣品，同一種PAH在相同樣品中的含量相差不大，都是犀牛角鎮(zhèn)的樣品PAHs值較城東市場的值大。將海鴨蛋的三個(gè)樣品部分分別進(jìn)行對比，PAHs總含量最高的是犀牛角鎮(zhèn)海鴨蛋的蛋殼部分，總含量為0.52 μg/g。城東市場組的蛋黃中PAHs的總含量為0.22 μg/g，平均含量為0.017 μg/g，蛋白中PAHs的總含量為0.2 μg/g，平均含量為0.015 μg/g，即食用部分（包括蛋白跟蛋黃）總含量為0.42 μg/g，平均含量為0.016 μg/g。犀牛角鎮(zhèn)組的蛋黃中PAHs的總含量為0.255 μg/g，平均含量為0.019 μg/g，蛋白中PAHs的總含量為0.22 μg/g，平均含量為0.017 μg/g，即食用部分（包括蛋白跟蛋黃）總含量為0.475 μg/g，平均含量為0.018 μg/g。

犀牛角鎮(zhèn)的PAHs含量大于城東市場的PAHs含量，主要是因?yàn)橄＝擎?zhèn)三面環(huán)海，是一座濱海城鎮(zhèn)。東臨大風(fēng)江，西、南面臨南海欽州灣。沿海有三娘灣、三墩漁場，以海水捕撈為主大力發(fā)展?jié)O業(yè)。相鄰沿海區(qū)域有相應(yīng)規(guī)模的港口碼頭，有機(jī)動(dòng)、非機(jī)動(dòng)漁船等。小鎮(zhèn)附近有少量工業(yè)存在，且人口聚集，人類生活污水排放。犀牛角鎮(zhèn)上的居民將海鴨于沿海紅樹林放養(yǎng)，產(chǎn)出的海鴨蛋就很容易遭受海洋傾廢、港口污染（港口碼頭作業(yè)的石油類排放）等，造成不同程度的PAHs蓄積。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 海鴨蛋中PAHs含量表

根據(jù)多環(huán)芳烴的環(huán)數(shù)，可將13種PAHs 按照環(huán)數(shù)將其分為2-3 環(huán)(萘、苊烯、苊、菲、蒽) ，4環(huán)(芘、苯并［a］蒽、?) ，5-6 環(huán)(苯并［b］熒蒽、苯并［k］熒蒽、苯并［a］芘、二苯并［a，h］蒽、苯并［g，h，i］苝) 。從整體上看，本文采樣點(diǎn)的海鴨蛋無論蛋黃還是蛋殼、蛋白樣品部分，高環(huán)數(shù)（4-6環(huán)）的PAH含量普遍比低環(huán)數(shù)（2-3環(huán)）的PAH含量高，所占總PAHs的比重較大，表明海鴨蛋中PAH主要以高環(huán)為主。可能原因是高環(huán)數(shù)（4-6環(huán)）的PAH的辛醇－水分配系數(shù)比低環(huán)數(shù)（2-3環(huán)）的PAH大，高環(huán)數(shù)（4-6環(huán)）的PAH更易富集于海鴨蛋中。

4 結(jié)論

本文建立了利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測海鴨蛋中13種多環(huán)芳烴含量的實(shí)驗(yàn)方法。對樣品萃取前先進(jìn)行皂化處理，采用超聲波萃取，使用硅膠固相萃取進(jìn)行凈化，能去除大部分干擾物質(zhì)，大大減低假陽性的機(jī)率，進(jìn)而提純樣品中的目標(biāo)物質(zhì)多環(huán)芳烴。13種多環(huán)芳烴在0.0～0.8μg/mL范圍內(nèi)呈良好的的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.991～0.999。空白加標(biāo)回收率為91.5%～101.3%，樣品加標(biāo)回收率為90.2%～102.4%，精密度RSD分別為1.9%～5.7%，方法檢出限在2.50～12.15 ng/L之間。本方法精密度良好，檢測結(jié)果可靠。

該方法下測定的城東市場的海鴨蛋中PAHs總含量較低，為0.42μg/g，平 均 值 為0.032μg/g， 各PAH的總含量范圍是 0.010～0.090μg/g；犀牛角鎮(zhèn)的海鴨蛋中PAHs總含量較高，為0.995μg/g，平均值為0.077μg/g，各PAH的總含量范圍是0.015～0.155μg/g。同一種PAH在相同樣品中的含量相差不大，但犀牛角鎮(zhèn)的PAHs含量普遍大于城東市場的PAHs含量，且兩處采樣點(diǎn)海鴨蛋中高環(huán)數(shù)（4-6環(huán)）的PAH含量普遍比低環(huán)數(shù)（2-3環(huán)）的PAH含量高。

本實(shí)驗(yàn)方法簡單，提取效率高、靈敏度高、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確有效地同時(shí)檢測出多種多環(huán)芳烴，對海鴨蛋中多環(huán)芳烴的的檢測具有重要的意義，也為同類物質(zhì)中多環(huán)芳烴的檢測提供有效的參考依據(jù)。