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      白扁豆多糖對人胃癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制*

      2018-08-29 05:16:44張艷姿柯瑞君蔣盼若楊林軍陳佳玉
      關(guān)鍵詞:白扁豆預(yù)冷培養(yǎng)箱

      張艷姿, 柯瑞君, 蔣盼若, 楊林軍, 陳佳玉

      (1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院, 浙江溫州 325035; 2. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江紹興312000; 3. 臺州市立醫(yī)院,浙江臺州318000; 4. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江臺州318000)

      胃癌是世界常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤第2位[1]。目前,手術(shù)切除仍是治療胃癌的最佳方法。但臨床上由于缺乏早期胃癌特異性診斷指標(biāo)、胃癌早期患者臨床癥狀不明顯等原因,很多胃癌患者確診時已達(dá)到胃癌進(jìn)展期甚至是晚期[2],其術(shù)后5年生存率不足20%[3]。因此,尋找對胃癌有治療效果、毒副作用小的藥物一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

      白扁豆具有抗菌、抗病毒、提高細(xì)胞免疫功能的作用[4]。近年來,越來越多的研究證實(shí),多糖在提高人體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化及降血糖等過程中起著重要作用[5-7],但白扁豆中的多糖對胃癌的作用及其作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本文擬探討白扁豆多糖誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制,以期為白扁豆多糖用于胃癌治療提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      細(xì)胞周期檢測試劑盒(凱基生物,江蘇);Cell Titer96 Aqueous Non-radioactive Cell proliferation Assay (MTS, Promega);Annexin V-PE/7-AAD apoptosis assays kit (BD);JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(天晶公司,上海);RPMI 1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶液、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS,Gibco);TrizolReagent、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System(Invitrogen);Hoechst 33342染色液 (Solarbio,上海)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。白扁豆多糖為本實(shí)驗(yàn)室從藥用白扁豆提取的多糖[8],純度為92%。人胃癌細(xì)胞株HGC-27和SGC-7901均購自ATCC細(xì)胞庫;引物由上海生工合成。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及MTS法檢測細(xì)胞增殖活性的抑制率

      取對數(shù)生長期的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞,胰酶液消化后,用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的密度調(diào)整為5×103cells/ml,分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,200 μl/孔,各設(shè)3個復(fù)孔。將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,分別用不同濃度的白扁豆多糖(終濃度為16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0 μg/ml)作用于該細(xì)胞,每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔。加藥后24 h、48 h和72 h時,分別向各培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl MTS溶液,再將其放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。用酶標(biāo)儀檢測490nm處吸光度(A490nm值),按下式計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率:抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組平均A490nm值/對照組平均A490nm值)]×100%。

      1.3 JC-1法檢測細(xì)胞膜電位

      取細(xì)胞懸液,調(diào)整其最終密度為1×104cells/ml,接種到6孔培養(yǎng)板中,每孔2 ml,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時,分別換成含0 μg/ml、4 μg/ml白扁豆多糖的完全培養(yǎng)液,各設(shè)3個復(fù)孔,于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞2次,每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液和1 ml JC-1染色工作液,充分混勻,于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。棄上清液,用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次。每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液,置熒光倒置顯微鏡下觀察。

      1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

      取對數(shù)生長期的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞,胰酶液消化后,用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的密度調(diào)整為5×104cells/ml,接種到6孔培養(yǎng)板中,每孔2 ml,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%,將培養(yǎng)基換成含有0 μg/ml、4 μg/ml白扁豆多糖的完全培養(yǎng)液,各設(shè)3個復(fù)孔,于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)上清,用PBS洗滌細(xì)胞2次,用不含EDTA的胰酶液消化6孔板內(nèi)的細(xì)胞,500×g離心5 min收集細(xì)胞,以4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,每次洗滌后于4 ℃、500×g離心5 min,棄上清。每孔加入250 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml;取100 μl細(xì)胞懸液于5 ml流式管中,同時加入5 μl Annexin V/PE和5 μl 7-AAD,輕輕混勻。避光、室溫下反應(yīng)15 min,加入400 μl 1×Binding Buffer,充分混勻,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。

      1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

      胰酶液消化后回收的上述經(jīng)0 μg/ml或4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞,用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,每次洗滌后于4 ℃、600×g離心5 min回收細(xì)胞。每組取5×106個細(xì)胞,分別加入1 ml冰浴預(yù)冷的70% 乙醇,輕輕吹打混勻,4 ℃條件下固定2 h。4 ℃、600×g離心5min,棄上清,用4℃預(yù)冷的PBS于同樣條件下離心洗滌細(xì)胞2次。向細(xì)胞沉淀中加入100 μl RNase A,37 ℃水浴孵育30 min,加入400 μl PI染色液,混勻,置于4 ℃避光作用30 min,流式細(xì)胞儀于激發(fā)波長488 nm下檢測。

      1.6 QPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平

      分別取上述經(jīng)0 μg/ml或4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞,完全棄去培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞2次;按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)Nanodrop儀器定量。取5 μg RNA樣品,用SuperScriptIII First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,QPCR法進(jìn)行Bax、Bcl-2和caspase-3基因表達(dá)水平的檢測,試劑用量參照說明書,引物序列見表1。

      Tab.1The primer sequence

      Gene nameForward primerReverse primerBcl-2 geneGGGTGGGAGGGAG-GAAGAATTTCGCAGAGGCATCA-CATCGBax geneCTCACCGCCTCACT-CACCATTGTGTCCCGAAGGAG-GTTTATTCaspase-3 geneGAGTAGATGGTTT-GAGCCTGAGTGCCTCACCACCTT-TAGAACGAPDH geneTGAAGGTCGGAGT-CAACGGCTGGAAGATGGTGATGG-GATT

      2 結(jié)果

      2.1 MTS法檢測細(xì)胞增殖活性

      MTS法檢測結(jié)果(表2)顯示,胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901經(jīng)濃度為16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml白扁豆多糖作用24 h、48 h和72 h后,其增殖活性受到不同程度的抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其受抑制程度與藥物濃度和作用時間有關(guān)。當(dāng)白扁豆多糖濃度為4 μg/ml、作用時間為24 h時,胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的細(xì)胞增殖抑制率分別為(52.12±2.27)%和(43.47±2.34)%,與0 μg/ml白扁豆多糖組差異顯著(P<0.01),因此選擇此濃度和作用時間進(jìn)行后續(xù)白扁豆多糖作用的機(jī)制研究。

      WLP(μg/ml)HCG-27SGC-790124 h48 h72 h24 h48 h72 h0000000110.03±0.9821.12±3.22*37.24±3.41**9.42±1.1717.67±2.84*25.71±2.66*225.17±1.19*38.22±5.17**48.15±6.15**21.22±2.04*31.17±5.19**49.38±5.27**452.12±2.27**61.19±5.33**71.01±5.44**43.47±2.34**56.52±4.68**73.43±6.22**869.28±6.46**78.58±4.62**89.34±2.01**54.41±5.49**61.22±7.14**80.42±7.64**1678.27±5.31**87.31±3.16**92.62±2.40**59.97±6.74**89.52±8.45**94.18±6.32**

      *P<0.05,**P<0.01vsthe group treated with 0 μg/ml white lentil polysaccharides(WLP)

      2.2 白扁豆多糖對細(xì)胞線粒體膜電位的影響

      熒光倒置顯微鏡檢測結(jié)果(圖1)顯示,胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h后,細(xì)胞線粒體膜電位明顯下調(diào)。

      Fig.1Effect of white lentil polysaccharides on mitochondrial membrane potential of gastric cancer cell lines HGC-27 and SGC-7901(40 ×)

      2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

      結(jié)果如圖2所示,經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖處理后,HGC-27和SGC-7901細(xì)胞凋亡率分別為53.15%和38.77%,較PBS處理組(8.07%和6.03%)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),4 μg/ml白扁豆多糖能誘導(dǎo)HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的凋亡。

      Fig.2The inducing apoptosis effect of white lentil polysaccharides on gastric cancer cell lines examined by a flow cytometery(n=3)

      *P<0.01vsthe group treated with 0 μg/ml white lentil polysaccharides

      2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

      結(jié)果如圖3所示,與未用藥處理組比較,經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖處理后,處于G1、S、G2期的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的比例無明顯變化。因此,4 μg/ml白扁豆多糖對HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響(P>0.05)。

      Fig.3Effect of white lentil polysaccharides on the cell cycle of gastric cancer cell lines HGC-27 and SGC-7901(n=3)

      2.5 QPCR檢測結(jié)果

      QPCR檢測結(jié)果(圖4)證實(shí),與未用藥處理組比較,經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h后,胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的凋亡相關(guān)蛋白Bax和caspase-3基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,而Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P<0.01)。

      *P<0.01vsthe group treated with 0 μg/ml white lentil polysaccharides

      3 討論

      細(xì)胞凋亡是由多種基因控制的細(xì)胞程序性死亡,是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)。它控制著細(xì)胞生長與分化的方向,當(dāng)細(xì)胞凋亡受抑制時,便可以引起包括胃癌在內(nèi)的一系列腫瘤的發(fā)生。胃癌嚴(yán)重威脅人類健康。因此,探索促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的新藥物并揭示其作用機(jī)制一直是胃癌治療研究的熱點(diǎn)和靶點(diǎn)。

      近年來,越來越多的研究證實(shí),多糖在提高機(jī)體免疫功能、抗腫瘤等過程中起著重要作用[4],如枸杞多糖可以誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞的凋亡[9]、(1→3)-β-D-葡聚糖連接的香菇多糖對S180荷瘤小鼠的腫瘤也有較高的抑制作用[5]。但目前有關(guān)白扁豆多糖抗胃癌的作用研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同濃度的白扁豆多糖作用后,胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的細(xì)胞凋亡率明顯增加,細(xì)胞增殖活性均受到不同程度的抑制,且其受抑制程度與藥物作用的濃度和時間有關(guān)。用藥前后HGC-27和SGC-7901的細(xì)胞周期無明顯變化。因此,白扁豆多糖可通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮抗胃癌作用。

      為了揭示白扁豆多糖誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,本研究進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因mRNA水平分析和細(xì)胞膜電位觀察。結(jié)果證實(shí),經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖作用后,胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的線粒體膜電位明顯降低,細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,而Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平卻較未用藥組明顯下降。Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,Bax和Bcl-2是該家族中最具代表性的蛋白質(zhì)[10,11]。在細(xì)胞正常生長和分化過程中,Bax為Bcl-2活性的主要調(diào)控因子[12],它與Bcl-2的表達(dá)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)藥物作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bax基因表達(dá)增多時,Bax不僅可以直接與細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2形成異二聚體,發(fā)揮其抑制Bcl-2的抑凋亡作用,而且還可以移位到細(xì)胞線粒體上[13],導(dǎo)致線粒體膜通透性增高,細(xì)胞膜電位下降,激活細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶caspase-3[14],進(jìn)而引起細(xì)胞廣泛的損傷和變性,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。因此,白扁豆多糖可以通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2和caspase-3基因的表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

      白扁豆是一種常用中藥,我國很多地區(qū)都有栽培,資源十分豐富。其營養(yǎng)豐富,價(jià)格低廉。此外白扁豆多糖對正常細(xì)胞無明顯的毒副作用[16]。因此,將白扁豆多糖作為抗腫瘤藥物成分進(jìn)行開發(fā)有較好的應(yīng)用前景。本研究為白扁豆多糖的進(jìn)一步臨床用藥研究奠定了基礎(chǔ)。

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