陳 茜，向 熙，楊漫漫,4，張婷婷，陳文彬，李 林，魏 強(qiáng),4，李 勇,,4*

(1.深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司，深圳 518000； 2.深圳華大生命科學(xué)研究院，深圳 518000； 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)華大教育中心，深圳 518000； 4.深圳動(dòng)物基因組輔助育種工程實(shí)驗(yàn)室，深圳 518000)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的主要惡性腫瘤之一[1-2]。我國(guó)雖然屬乳腺癌低發(fā)國(guó)家，但人口基數(shù)大，乳腺癌已然成為我國(guó)女性發(fā)病率最高的癌癥，嚴(yán)重威脅了廣大女性的生命健康[3]。BRCA1(breast cancer susceptibility gene1)是最先被發(fā)現(xiàn)的高共顯乳腺癌易感基因。研究發(fā)現(xiàn)，有乳腺癌家族史的婦女中, BRCA1的基因突變比例可達(dá)15%～20%；在同時(shí)具有乳腺癌和卵巢癌家族史的婦女中，BRCA1的基因突變比例更高，甚至高達(dá)60%～80%[4]。除了BRCA1外，BRCA2(breast cancer susceptibility gene 2)和CDH1(cadherin gene 1)也是迄今為止發(fā)現(xiàn)重要乳腺癌易感基因。大規(guī)模乳腺癌群體的高通量測(cè)序及分析研究也證實(shí)，BRCA1、BRCA2和CDH1三個(gè)基因結(jié)構(gòu)和功能的異常與乳腺癌的發(fā)病密切相關(guān)[5]。

為了探索乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和探討新的治療方法，國(guó)內(nèi)外研究者需借助更貼近于人類(lèi)的原發(fā)性乳腺癌動(dòng)物模型，而制備BRCA1/BRCA2/CDH1基因乳腺特異性修飾小鼠是建立該模型的有效途徑。雖然基于基因敲除的小鼠模型在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但部分腫瘤驅(qū)動(dòng)基因在動(dòng)物體內(nèi)的全身性純合敲除具有胚胎致死性，很難進(jìn)行后續(xù)的機(jī)理藥理研究，典型的如BRCA1和BRCA2[6]。對(duì)于這些致死性基因的失活，多采用組織特異性敲除的方法，其原理是利用同源重組的方法在敲除區(qū)域兩側(cè)插入loxp片段(floxp)，隨后floxp小鼠與組織特異性表達(dá)Cre重組酶的小鼠雜交，Cre重組酶可識(shí)別并折疊剪切l(wèi)oxp中間的片段，達(dá)到組織特異性敲除特定基因的目的[7]。但該方法步驟繁瑣，失敗率高，周期長(zhǎng)，不利于科研的開(kāi)展。利用組織特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)CAS9蛋白的表達(dá)，并結(jié)合全身性single guide RNA的表達(dá)，能在動(dòng)物個(gè)體的特定組織或細(xì)胞群中結(jié)合成CRISPR/Cas9 RNP (ribonucleoproteins)復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)靶基因的組織特異性編輯。該方法大大縮短了組織特異性敲除動(dòng)物的制備周期和難度，已在斑馬魚(yú)[8]、果蠅[9]、小鼠[10]等模式動(dòng)物中得到很好的應(yīng)用。

本研究選取BRCA1、BRCA2和CDH1三個(gè)乳腺癌高頻易感基因?yàn)榘谢蛭稽c(diǎn)，以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建乳腺組織特異性的CAS9蛋白以及三條sgRNA共表達(dá)載體，通過(guò)原核注射的方式將載體序列整合到小鼠基因組中，制備轉(zhuǎn)基因小鼠，使整個(gè)表達(dá)框在個(gè)體中穩(wěn)定表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)乳腺組織特異性的多基因敲除。與傳統(tǒng)的同源重組及Cre-loxp的方法相比，本實(shí)驗(yàn)的周期與成本可以縮短至三分之一，方便快捷地構(gòu)建出乳腺組織特異性敲除小鼠，對(duì)其進(jìn)行深入研究將對(duì)遺傳性乳腺癌的發(fā)生機(jī)制、早期診斷及治療有著重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體重25～30 g，7～8周齡，雌性30只，雄性5只。購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SCXK(京)2013-0002]，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建及飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所進(jìn)行[SYXK(京)2013-0014]。倫理審查號(hào)：BGI-IRB17213。

1.2 主要材料

HEPA細(xì)胞(小鼠肝癌細(xì)胞)購(gòu)自上海研域生物工程有限公司；CRR質(zhì)粒(可單獨(dú)表達(dá)sgRNA的載體，由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成)；pCMV-spCas9質(zhì)粒(可單獨(dú)表達(dá)Cas9的載體，由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成)；pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體購(gòu)自Biovector公司。

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；premix ExTaq、T7核酸內(nèi)切酶I、普通質(zhì)粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒、In-Fusion HD Cloning kits、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 sgRNA設(shè)計(jì)及活性鑒定

針對(duì)小鼠BRCA1基因序列 (Gene ID:12189)，利用sgRNA在線(xiàn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu/)在其第10外顯子設(shè)計(jì)并合成了1條特異識(shí)別靶序列DNA的sgRNA。合成的sgRNA及互補(bǔ)鏈經(jīng)變性退火 (程序?yàn)椋?5℃ 10 min; 25℃ 30 min)，形成帶有粘性末端的雙鏈核苷酸，再連入經(jīng)BbsⅠ酶切回收的pX330載體骨架中，命名為pX330(B1)。BRCA2及CDH1基因位點(diǎn)的sgRNA則是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道各選取一條具有活性的gRNA直接合成[11-12]，將BRCA2 sgRNA、CDH1 sgRNA分別連入經(jīng)BsaI酶切回收的CRR載體骨架中，命名為CRR(B2)和CRR(C1)。構(gòu)建好的表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證連接正確后，提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

pX330(B1)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染HEPA細(xì)胞，CRR(B2)載體和CRR(C1)載體與pCMV-spCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEPA細(xì)胞(CRR載體與pCMV-spCas9質(zhì)粒質(zhì)量比為1∶1)。當(dāng)24-well HEPA細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%時(shí)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，48 h后分別收集細(xì)胞并提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增sgRNA切割靶點(diǎn)上下游DNA片段(如圖1 A)，產(chǎn)物經(jīng)T7程序變性退火后再經(jīng)T7核酸內(nèi)切酶I酶切。引物信息見(jiàn)表1，反應(yīng)體系如下：

PCR 擴(kuò)增體系：細(xì)胞基因組DNA 0.1 μg，premix ExTaq 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：(98℃ 15 s;55℃ 30 s;72℃ 1 min)×32cycles。

T7變性程序：95℃ 10 min;95℃～85℃(-2.0℃/s);85℃～25℃(-0.3℃/s);25℃ 1 min。

T7酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物18 μL，NEBuffer2 2 μL，T7EI 0.2 μL。反應(yīng)條件：37℃ 45 min。

1.3.2 WAP啟動(dòng)子的擴(kuò)增

為確保Cas9基因在小鼠乳腺組織中特異性表達(dá)，根據(jù)小鼠基因組序列擴(kuò)增乳腺組織特異性表達(dá)的WAP啟動(dòng)子，并在兩端加入pX330骨架同源序列，與去除CBh啟動(dòng)子的pX330質(zhì)粒骨架連接(KpnI和AgeI雙酶切)，重組質(zhì)粒命名為pX330(WAP-Cas9-U6-B1)。

1.3.3 共表達(dá)載體的構(gòu)建

擴(kuò)增CRR(B2)載體上U6-BRCA2sgRNA表達(dá)框，連入經(jīng)NotI酶切后的pX330(WAP-Cas9-U6-B1)骨架，命名為pX330(WAP-Cas9-U6-B1B2)。擴(kuò)增CRR(C1)載體上U6-CDH1sgRNA表達(dá)框，連入經(jīng)NotI酶切后的pX330(WAP-Cas9-U6-B1B2)骨架，通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶SbfI酶切鑒定重組后的質(zhì)粒，將終載體命名為pX330(WAP-Cas9-U6-B1B2C1)(如圖1B)，并回收線(xiàn)性化質(zhì)粒，制備原核顯微注射液。構(gòu)建共表達(dá)載體所需引物信息如表2。

表1 sgRNA設(shè)計(jì)及活性鑒定引物Table.1 The primers for sgRNAs and identification of their activity

注：A：BRCA1、BRCA2和CDH1三基因sgRNA及鑒定引物設(shè)計(jì)示意圖；B：共表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖，包含WAP啟動(dòng)子、U6-BRCA2-sgRNA、U6-CDH1-sgRNA。圖1 BRCA1、BRCA2和CDH1三基因sgRNA及共表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖Note.A:Schematic diagram of sgRNAs in BRCA1、BRCA2 and CDH1 gene and the primers for identification.B：Schematic diagram of the final carrier structure, Including WAP promoter, U6-BRCA2-sgRNA, U6-CDH1-sgRNA.Figure.1 Schematic diagram of sgRNAs for BRCA1, BRCA2, and CDH1 genes and the structure of the final carrier

引物名稱(chēng)Primer name引物序列(5'～3')Primer sequenceWAP-infusion-FCAAATGGCTCTAGAGGTACCCTCTAAGTAGAGGGGAAGAAAWAP-infusion-RCCATGGTGGCACCGGTGGTACCGGTGTCAGGCAAGTGBRCA2-infusion-FCAGGCATGCTGGGGAGCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTBRCA2-infusion-RCTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCCDH1-infusion-FTCGGTGCTTTTTTTGCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTCDH1-infusion-RAGGGGTTCCTGCGGCCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC

1.3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠制備

實(shí)驗(yàn)第1天8:00 小鼠腹腔注射每只PMSG 7.5 IU。48 h后，實(shí)驗(yàn)第3天小鼠腹腔注射每只HCG 7.5 IU，注射后立即與雄鼠1∶1合籠。實(shí)驗(yàn)第4天8:00～9:00檢查陰道栓，有陰道栓的小鼠備注日期和陽(yáng)性，對(duì)陽(yáng)性小鼠進(jìn)行受精卵收集。向受精卵雄性原核注入顯微注射液后，移植到假妊娠小鼠輸卵管中，每只移入25～35枚合子。移植后將小鼠置于安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)，19～21 d分娩產(chǎn)仔。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的鑒定

剪取出生1周新生小鼠尾巴，通過(guò)試劑盒提取小鼠基因組DNA，具體提取方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)轉(zhuǎn)基因載體上的特異DNA序列進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR鑒定產(chǎn)物跨WAP啟動(dòng)子和Cas9 基因，引物見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)體系同1.3.1。

轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性母鼠受孕分娩后，于哺乳后期采集母鼠乳腺、腎、胃、腦、脂肪和肝組織，并采集非哺乳期的母鼠乳腺、腎、胃、腦、脂肪和肝組織作為對(duì)照。Trizol法提取組織RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用反轉(zhuǎn)錄引物擴(kuò)增鑒定，引物見(jiàn)表3。

GAPDH引物作為內(nèi)參引物，同時(shí)擴(kuò)增乳腺、腎、胃、腦、脂肪和肝組織，引物序列見(jiàn)表3。

反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 1 μg，Oligo(dT)181 μL，2X TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNase-free Water補(bǔ)至20 μL。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃反應(yīng)30 min，85℃加熱5 s 失活TransScript RT。

RT-PCR擴(kuò)增體系：cDNA 2 μL，premix ExTaq 5 μL，反轉(zhuǎn)錄上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至10 μL。

RT-PCR反應(yīng)條件：(98℃ 10 s;60℃ 30 s;72℃ 20 s)×35cycles。

GAPDH引物PCR反應(yīng)條件同上。

同時(shí)，試劑盒法提取這6個(gè)組織的基因組DNA，PCR分別擴(kuò)增共表達(dá)載體上sgRNA切割靶點(diǎn)上下游DNA片段，產(chǎn)物經(jīng)T7程序變性退火后再經(jīng)T7核酸內(nèi)切酶I酶切。引物信息見(jiàn)表4。

PCR 擴(kuò)增體系：基因組DNA 0.1 μg，premix ExTaq 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至20 μL。

PCR反應(yīng)條件：(98℃ 15 s;55℃ 30 s;72℃ 1 min)×32cycles。

T7變性程序和T7酶切反應(yīng)體系見(jiàn)1.3.1。

表3 轉(zhuǎn)基因鑒定引物及反轉(zhuǎn)錄鑒定引物Table.3 The primers for identifying transgenes and reverse transcription

表4 共表達(dá)載體活性鑒定引物Table.4 The primers for identifying coexpression vector activity

圖2 BRCA1、BRCA2及CDH1 gRNA測(cè)序驗(yàn)證Figure.2 gRNAs for BRCA1, BRCA2, and CDH1 sequencing

2 結(jié)果

2.1 CRISPR載體構(gòu)建及活性鑒定結(jié)果

BRCA1、BRCA2和CDH1三個(gè)基因的sgRNA分別連入載體骨架后，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明三條sgRNA均成功連入載體中(圖2)。三套CRISPR系統(tǒng)分別轉(zhuǎn)染HEPA細(xì)胞后進(jìn)行sgRNA活性驗(yàn)證，結(jié)果顯示三條sgRNA均有活性(圖3)，T7酶切后目的條帶與預(yù)期一致：BRCA1:979 bp=440 bp+539 bp; BRCA2:408 bp=329 bp+79 bp; CDH1:731 bp=348 bp+369 bp。

2.2 共表達(dá)載體鑒定

BRCA1sgRNA連入pX330骨架，BRCA2sgRNA和U6-CDH1sgRNA整個(gè)表達(dá)框依次連入pX330(WAP-Cas9-U6-B1)酶切骨架和pX330(WAP-Cas9-U6-B1B2)酶切骨架。并成功將CBh啟動(dòng)子替換為WAP啟動(dòng)子。重組后的質(zhì)粒pX330(WAP-Cas9-U6-B1B2C1)經(jīng)SbfI酶切鑒定條帶大小正確(圖4)。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鑒定

通過(guò)原核注射的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，共注射受精卵190枚，4只受體鼠移植卵共130枚，最終一共產(chǎn)下仔鼠42只。通過(guò)檢測(cè)鑒定11只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠，陽(yáng)性率為26.19%。將F0代陽(yáng)性鼠與野生型小鼠交配，得到39只F1代仔鼠，經(jīng)鑒定共得到9只F1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠(圖5)。

注：A1：F0代小鼠PCR鑒定結(jié)果；M：200 bp marker，1～42：42只F0小鼠樣品，其中11只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；B：空白對(duì)照；A2：F1代小鼠PCR鑒定結(jié)果；M：200 bp marker，1～39：39只F1小鼠樣品，其中9只為轉(zhuǎn)基因鼠。圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定Note.A1:PCR analysis of F0 mice.M: 200 bp marker.1-42:42 Samples which include 11 transgenic mice.P: Positive control with plasmid. N: Negative control with wild mouse.B: blank control with H2O, the same below.A2: PCR analysis of F1 mice.M: 200 bp marker.1-39:39 Samples which include 9 transgenic mice.Figure.5 Identification of transgenic mice

2.4 Cas9基因表達(dá)情況鑒定

Cas9基因的表達(dá)鑒定結(jié)果顯示陽(yáng)性母鼠乳腺組織cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小跟預(yù)期一致，為298 bp，但胃和肝中也擴(kuò)增出微弱的目的條帶，見(jiàn)圖6。同時(shí)，我們?cè)诜敲谌槠谀甘笕橄?、腎、胃、腦、脂肪、肝等組織中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WAP啟動(dòng)子調(diào)控的Cas9基因主要在泌乳期乳腺組織中表達(dá)。

2.5 T7酶切活性鑒定

提取陽(yáng)性及野生母鼠乳腺、腎、胃、腦、脂肪、肝組織DNA，分別用鑒定引物擴(kuò)增，T7酶切鑒定靶基因的剪切效果。結(jié)果顯示CDH1基因有剪切活性，且僅在陽(yáng)性母鼠乳腺組織發(fā)生剪切，T7酶切后目的條帶與預(yù)期一致：1231 bp=570 bp+661 bp(圖7)。BRCA1和BRCA2兩個(gè)基因T7酶切后沒(méi)有出現(xiàn)剪切后條帶，有可能這兩個(gè)基因的剪切效率較低，未能通過(guò)T7酶切方法檢測(cè)出。

圖3 BRCA1、BRCA2及CDH1 gRNA活性鑒定結(jié)果Figure.3 Identification of activity of three gRNAs

3 討論

乳腺癌在世界范圍內(nèi)已成為女性的頭號(hào)惡性腫瘤。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)果，探討它們的作用機(jī)制有助于乳腺癌預(yù)防、早期診斷及為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)資料表明5%～10%的乳腺癌和遺傳易感性相關(guān)，這其中最常見(jiàn)的乳腺癌易感基因是BRCA1和BRCA2，其次還有CDH1、P53、PTEN、STK11/LKB1等[13]。研究表明BRCA1和BRCA2基因的突變可以顯著提高乳腺、前列腺、卵巢癌的發(fā)病率。據(jù)統(tǒng)計(jì)5%～10%的乳腺癌屬于單基因?qū)е碌?，而B(niǎo)RCA1和BRCA2雙基因突變可以顯著提高腫瘤外顯性，占總體乳腺癌發(fā)病率的30%左右[14]。BRCA1和BRCA2基因與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)有關(guān)，它們的突變可導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞正常分化，最終誘發(fā)了腫瘤的發(fā)生[15]。CDH1是一類(lèi)細(xì)胞粘附相關(guān)因子，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，該基因的突變是乳腺小葉癌的主要成因[16]。盡管有非常多關(guān)于BRCA1、BRCA2、CDH1和乳腺癌相關(guān)的研究，然而由于這些基因突變都是胚胎致死性，需要通過(guò)組織特異性的敲除才能很好的研究這些基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。

圖4 pX330(WAP-Cas9-U6-B1B2C1)載體限制性?xún)?nèi)切酶酶切驗(yàn)證結(jié)果Figure.4 Restriction enzyme digestion identification of pX330 (WAP-Cas9-U6-B1B2C1)

注：A1：RT-Cas9-PCR引物鑒定Cas9表達(dá)結(jié)果；B：空白；M：100 bp marker；1～6：陽(yáng)性母鼠乳腺、腎、胃、腦、脂肪和肝組織的cas9表達(dá)情況；A2：GAPDH擴(kuò)增結(jié)果。圖6 Cas9基因表達(dá)情況鑒定Note.A1:RT-Cas9-PCR to identify Cas9 expression results.B: Negative control with H2O.M: 100 bp Marker.1-6: The cas9 expression of breast tissue, kidney, stomach, brain, fat, liver in positive mice.A2:GAPDH PCR results.Figure.6 Identification of Cas9 gene expression

注：M：100 bp marker；+：陽(yáng)性小鼠；W：野生小鼠。圖7 CDH1基因T7酶切活性鑒定結(jié)果Note.M: 100 bp marker.+: Positive mice.W: Wild mice.Figure.7 Results for identifying CDH1 gene T7 enzyme activity

CRISPR/Cas9技術(shù)是近幾年快速發(fā)展的基因組編輯新技術(shù)，和鋅指核酸酶 (zinc finger endonuclease, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 一樣，都可以定向編輯細(xì)胞和個(gè)體的基因組序列。與其它兩項(xiàng)技術(shù)相比，CRISPR/Cas9具有構(gòu)建方便，高效，更多的可供靶向位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)[17-19]。此外，CAS9基因在特異性啟動(dòng)子的介導(dǎo)下，可以進(jìn)行時(shí)空特異性的基因組編輯或基因調(diào)控，這為基因組織特異性編輯或調(diào)控提供了可能。傳統(tǒng)組織特異性敲除主要依賴(lài)特異性表達(dá)CRE酶介導(dǎo)的基因片段刪除，早期人們利用這種方法制備出多種乳腺特異性敲除小鼠模型[20]，然而該技術(shù)需要進(jìn)行多輪的雜交試驗(yàn)才能實(shí)現(xiàn)，尤其是多基因刪除，需要更長(zhǎng)的時(shí)間與大的實(shí)驗(yàn)群體才能得到。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CRISPR /Cas9 技術(shù)，以pX330質(zhì)粒為骨架，將體外鑒定過(guò)能有效編輯BRCA1、BRCA2和CDH1三個(gè)基因的sgRNAs表達(dá)框同時(shí)連入一個(gè)表達(dá)載體，構(gòu)建出可以同時(shí)編輯三個(gè)基因的共表達(dá)載體系統(tǒng)，并與乳腺組織特異性啟動(dòng)子-WAP啟動(dòng)子調(diào)控的CAS9表達(dá)框一起形成多基因組織特異性表達(dá)系統(tǒng)。因此，本研究利用該技術(shù)可一次性獲得3個(gè)基因修飾的小鼠，避免了多輪雜交的過(guò)程，節(jié)省了時(shí)間和成本。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核注射的方法獲得了11只F0代的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，其中3只為雌性小鼠。隨后將F0代陽(yáng)性鼠進(jìn)行擴(kuò)繁，采集部分泌乳期陽(yáng)性小鼠不同組織樣本，并檢測(cè)CAS9基因表達(dá)與靶基因編輯情況，結(jié)果表明泌乳期乳腺組織能高表達(dá)CAS9基因，且CDH1基因產(chǎn)生了乳腺特異性剪切。而WAP啟動(dòng)子在泌乳期的其他組織也有微量表達(dá)，這與之前的研究類(lèi)似[21]。本研究成功獲得了乳腺組織特異性多基因編輯小鼠模型，與CRE酶介導(dǎo)BRCA1、BRCA2條件性敲除類(lèi)似，該模型主要依賴(lài)于乳腺特異性啟動(dòng)子-WAP啟動(dòng)子的活性[22]。先前研究表明，在第一個(gè)妊娠期之前檢測(cè)不到WAP啟動(dòng)子活性，而在妊娠中期(d15-d17)表達(dá)量激增[23-24]，因此至少要經(jīng)過(guò)一個(gè)妊娠泌乳期才能啟動(dòng)基因的表達(dá)[25-26]。盡管這會(huì)導(dǎo)致乳腺癌模型的制備周期延長(zhǎng)，但這種體細(xì)胞累積性突變更加接近人類(lèi)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。我們知道絕大部分人類(lèi)腫瘤的發(fā)生是靶組織中體細(xì)胞基因突變不斷積累的結(jié)果，人們很難通過(guò)人體自身闡述腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，這必須借助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。WAP啟動(dòng)子介導(dǎo)的CAS9基因表達(dá)，在特定時(shí)期乳腺的體細(xì)胞中不斷累積BRCA1、BRCA2和CDH1基因突變，很好的模擬了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，為我們闡述乳腺癌的形成機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。此外，利用該方法制備的乳腺癌模型為藥物靶點(diǎn)及靶向藥物治療提供了有利支持。