內側前額葉的小清蛋白神經元調控抑郁樣行為

耿飛 陳遠壽 羅蕓 田丹 盧癸鳳

遵義醫(yī)學院1生理學教研室，2病理生理學教研室（貴州遵義 563000）

低沉的情緒、缺乏動機或希望和快感缺乏是重癥抑郁的常見癥狀［1］。臨床抑郁癥治療的副作用提示需要進一步加深對抑郁行為的理解。之前的研究表明，重癥抑郁和前額葉的紊亂緊密相關［2］。電刺激內側前額葉可以誘導出抗抑郁樣的行為［3］。而且，激活內側前額葉的興奮性神經元可以調控焦慮抑郁樣行為［4］。絕經后抑郁的女性存在突觸傳遞的改變［5］。這些發(fā)現(xiàn)顯示，抑郁可能是內側前額葉的細胞或者突觸改變所導致的。

在過去20～30年中，分子、細胞、基因和成像技術的發(fā)展，讓人們對包括焦慮、抑郁在內的社會行為有了更深入的理解［6-7］。而基于動物行為的研究已經成為生物學和生物醫(yī)學領域研究社會行為及其神經機制的基礎［8-9］。前額葉及其眾多的交互連接在社會行為中發(fā)揮了重要的角色［10-11］。

內側前額葉存在不同種類的中間神經元，這些中間神經元和局部的錐體神經元進行聯(lián)系。之前的研究［12］表明，用Hm4Di抑制內側前額葉的小清蛋白神經元能促進無助行為。之前的研究［13-14］證據(jù)也顯示了抑郁癥和內側前額葉中間神經元受損的功能及數(shù)目的減少緊密相關，因此，前額葉小清蛋白神經元可能參與抑郁相關行為。

為了驗證此假說，實驗中選擇性地在內側前額葉小清蛋白神經元調控其活動，通過懸尾實驗、糖水偏好實驗及曠場試驗來檢測小鼠的抑郁樣行為及運動能力。本項研究擬明確內側前額葉小清蛋白神經元在抑郁行為中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物PV?cre轉基因小鼠（7～9周；Jackson Labs，B6；129P2?Pvalbtm1（cre）Arbr/J）被用于此項研究。所有的小鼠在8周齡時進行實驗。6只小鼠一籠，12 h的光/暗周期（開燈時間從早上8：00到下午8：00）。小鼠隨意進水進食。

1.2 病毒腺相關病毒5型包裝的病毒，滴度大于2 × 1012/mL。AAV?DIO?ChR2?EGFP和AAV?DIO?EGFP的病毒購自上海生博公司。

1.3 方法

1.3.1 立體定位手術，病毒注射和套管埋置小鼠用氯胺酮（100 mg/kg），去除頭頂毛發(fā)后固定在立體定位儀上。手術鉆孔開顱，用33?G（Hanmil?ton）的針頭給予0.5μL的AAV5病毒到雙側的內側前額葉（2，±0.4，-1.5）。10μL漢密爾頓的微量注射器（nanofil；WPI，Sarasota，F(xiàn)L）在微量注射泵（UMP3；WPI，Sarasota，F(xiàn)L）的控制下被用來注射腺相關病毒。注射速率0.1μL/min。隨后埋管，比病毒注射位點高0.5 mm（2，0，-1.0），離子水門汀粘合，然后用套管帽封閉套管。行為學實驗在埋管后的3周進行。

1.3.2 曠場實驗曠場測試箱（40 cm×40 cm）分為一個中央?yún)^(qū)域和外部。單個小鼠放在外圍的區(qū)域，并且動物的運動路徑被攝像機記錄。運動總距離和在中央?yún)^(qū)域所待時間通過軟件進行分析，運動軌跡通過上海吉量公司行為軟件分析。

1.3.3 糖水偏好實驗小鼠事先禁水過夜，糖水偏好檢測箱被用來檢測小鼠吸吮糖水或普通水的次數(shù)。糖水的濃度是1%。

1.3.4 懸尾實驗該實驗采用MED Associates懸尾設備對小鼠的運動狀態(tài)進行實時監(jiān)測。懸尾箱大小為：32 cm×33 cm×33 cm。用膠布制作成小鉤，將4只小鼠尾部（約2 cm處）粘住并懸掛于壓力傳感器處，計算機自動記錄每只小鼠在每分鐘內的累計不動時間。

1.3.5 腦片準備小鼠先用乙醚麻醉，迅速的剪斷頸部，在冰凍的人工腦脊液上取出大腦。用震動切片機（VT 1000S；Leica）切下包含內側前額葉的橫切片。切下腦片后，腦片被放置在32℃的記錄液中恢復活性。所有的溶液都通有95%O2/5%CO2（V/V）的混合氣。

1.3.6 體外膜片鉗電生理記錄腦片被放置在記錄槽內，細胞鉗制在-70 mV。記錄抑制性電流的電極內液包含的成分為：140 mmol/L CsCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2，10 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES?CsOH，2 mmol/L adenosine triphosphate，5 mmol/L QX?314。記錄興奮性突觸后電流時的電極內液的成分為：130 mmol/L K?gluconate，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L Hepes，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，0.13 mmol/LCaCl2·2H2O，3.5 mmol/LMg?ATP，1 mmol/L Na?GTP（pH 7.35，285 mOsm）。所有的試劑購買自Sigma或Tocris公司。

1.3.7 免疫熒光將小鼠用水合氯醛麻醉，灌注固定的小鼠腦袋用冰凍切片機進行切片，切片厚度25～40μm。腦片首先使用含有0.3%Triton X?100的牛血清白蛋白（BSA）封閉1.5 h，接著4℃孵育小清蛋白一抗（Swant235；1∶1 000）過夜。第2天加入熒光二抗（ALEXA 594?Goat anti Rabbit 1∶800）。室溫避光孵育1 h，封片，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0的統(tǒng)計軟件包處理，多組間比較采用雙因素方差分析，組間兩組比較采取方差分析后的多重比較，取α=0.05為檢驗標準。

2 結果

2.1 內側前額葉攜帶光敏感通道病毒的表達首先對PV?cre小鼠的內側前額葉腦區(qū)注射腺相關病毒5型（AAV5）病毒，該病毒ChR2下游插入增強型的綠色熒光蛋白，不含有光敏感通道的病毒作為對照病毒。熒光實驗發(fā)現(xiàn)紅色熒光可以和綠色熒光共表達，而且紅色熒光細胞多于綠色熒光細胞（圖1A）。

473 nm藍光刺激腦片可以記錄到攜帶熒光蛋白的神經元的光控誘導電流（圖1B），并且可以隨著頻率的增加（5、10和20 Hz）而穩(wěn)定的誘導（圖1C）。激活內側前額葉帶熒光的神經元同樣誘導出動作電位，而且也可以隨著頻率的增加（5、10和20 Hz）而穩(wěn)定的誘導出來（圖1D）。而對照病毒表達后，記錄不到這些電生理結果（未列出）。這些結果表明了光敏感通道成功表達于內側前額葉小清蛋白神經元。

Fig.1 Expression of ChR2?EGFPvirus in mPFC圖1 內側前額葉中ChR2病毒的表達

2.2 懸尾實驗為了探索內側前額葉小清蛋白神經元在抑郁樣行為中的作用，實驗采用光控遺傳學手段，通過懸尾實驗來檢測小鼠的行為學效應。首先比較了接受光控激活照射小鼠（PV：ChR2）和相應的對照小鼠（PV：EGFP）（圖2A）。激活內側前額葉的小清蛋白神經元可以減少懸尾實驗中小鼠的不動時間（圖2B：F=7.37，P=0.015；F=4.68，P=0.046。圖2C：F=12.98，P=0.002 6）。

圖2 興奮內側前額葉小清蛋白神經元對懸尾實驗的影響Fig.2 Effect of excitation of the mPFCparvalbumin neurons in the tail?suspension test

2.3 曠場試驗為了排除兩組小鼠之間運動能力不同所導致的結果差異，應用曠場實驗比較了接受光控激活照射小鼠（PV：ChR2）和相應的對照小鼠（PV：EGFP）的運動能力。結果顯示，激活內側前額葉的小清蛋白神經元對小鼠的運動功能并沒有受到影響（F=1.67，P=0.33），兩組小鼠的運動曲線比較接近。見圖3。

2.4 糖水偏好實驗為了探索內側前額葉小清蛋白神經元在糖水偏好中的作用，采用糖水偏好實驗來檢測小鼠的行為。90 min的實驗時程里，中間30 min給予光照（圖4A）。結果顯示，激活內側前額葉的小清蛋白神經元可以增加小鼠的糖水偏好（F=5.35，P=0.039；圖4B）。

圖3 興奮內側前額葉小清蛋白神經元對曠場實驗的影響Fig.3 Effect of excitation of the mPFCparvalbumin neurons in the open field test

圖4 興奮內側前額葉小清蛋白神經元對曠場實驗的影響Fig.4 Effect of excitation of the mPFCparvalbumin neurons in the sucrose preference test

3 討論

人的前額葉被分為眶額葉皮層、背外側前額葉、腹外側前額葉及內側前額葉，它們參與了眾多的社會行為過程［15-16］。其中，內側前額葉在人的社會認知等行為中發(fā)揮了關鍵的角色［17-18］。顯而易見，缺乏內側前額葉或前額葉紊亂會導致社會行為受損，產生類似焦慮、抑郁樣等行為疾病［19-20］。

在本研究中，探討了內側前額葉小清蛋白神經元在抑郁樣行為中的影響。首先，為了特異性調控小清蛋白神經元的活動，實驗中將Cre酶依賴性表達的攜帶有光敏感通道的病毒表達在PV?cre轉基因小鼠上。體內行為學結果顯示，激活了小清蛋白神經元后小鼠表現(xiàn)為抗抑郁樣效應：小鼠在懸尾實驗中掙扎的時間增加，并且在糖水偏好實驗中表現(xiàn)了更強的糖水偏好。而曠場實驗的結果表明這些結果并不是由于不同組間小鼠運動能力的不同導致的。

免疫熒光結果顯示，病毒所攜帶的熒光主要表達在小清蛋白神經元上。然而，熒光蛋白的表達并不能直接證明光敏感通道成功表達在細胞膜上。離體腦片光刺激可以記錄到光控誘導電流和動作電位，為內側前額葉中光敏感的成功表達提供直接證據(jù)。因此保證了行為上的可靠性。

激活小鼠內側前額葉小清蛋白神經元表現(xiàn)了抗抑郁樣的效應，這與之前的文獻報道是相吻合的。之前的研究發(fā)現(xiàn)，增強錐體神經元的興奮性傳遞促進無助行為［21］，這顯示了內側前額葉局部腦區(qū)興奮性和抑制性失去平衡，這可能是由于小清蛋白等中間神經元或者錐體神經元結構功能的改變所導致。而利用Hm4Di抑制內側前額葉的小清蛋白神經元則更加直接地表明了小清蛋白神經元能促進無助行為［12］，當然此無助行為模型與本研究的檢測方法不同。

皮層小清蛋白神經元深刻地影響著錐體神經元發(fā)放的時程及模式，從而參與神經網(wǎng)絡震蕩的產生和維持［11］。文獻報道內側前額葉小清蛋白神經元在恐懼記憶和防御反應［22］等過程中發(fā)揮著重要角色，關于小清蛋白神經元在不同行為中的作用還有待于進一步的研究。然而，此研究應用新的方法，特異性地調控局部腦區(qū)的特定神經元，從而揭示了內側前額葉小清蛋白神經元在抑郁樣行為的作用。

本研究揭示了內側前額葉小清蛋白神經元在無助行為及快感缺乏中的效應，從而強烈提示了其參與了抑郁相關行為的進程，而具體的作用機制還有待于進一步的探討。