袁艷敏 劉福利 梁洲瑞 汪文俊 孫修濤 王飛久

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海帶基因的克隆、分析及轉(zhuǎn)錄水平定量研究

袁艷敏1,2劉福利2,3①梁洲瑞2汪文俊2孫修濤2王飛久2

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

本研究以海帶()‘海天1號’為材料，通過RACE-PCR方法獲得海帶()基因全長cDNA序列。序列分析表明，全長cDNA長度為3778 bp，含有１個2892 bp的開放閱讀框，5?和3?非編碼區(qū)的長度分別為101、785 bp。蛋白質(zhì)氨基酸含量和理化性質(zhì)分析顯示，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。應用BLASTP程序?qū)Σ煌锓NHSP70蛋白比較分析表明，海帶與長囊水云()的HSP70蛋白具有較高的同源性，用HSP70蛋白構(gòu)建的進化樹顯示，海帶與長囊水云聚為一類。二級結(jié)構(gòu)預測該蛋白由963個氨基酸組成，包含35個α螺旋和25個β折疊。以釀酒酵母()HSP110蛋白三維結(jié)構(gòu)3C7N為模板，在I-TASSER軟件上預測海帶HSP70蛋白的三維結(jié)構(gòu)，預測的蛋白結(jié)構(gòu)與3C7N的A鏈在折疊和二級結(jié)構(gòu)方面非常類似。對基因在溫度脅迫下表達變化分析表明，高溫對的表達量具有顯著影響，在25℃、24 h脅迫條件時，表達量達到最大值。本研究為闡明海帶HSP70蛋白特性及其應對環(huán)境脅迫的機理提供理論依據(jù)。

海帶‘海天1號’；HSP70；RACE；生物信息學分析；熒光定量PCR

熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是由暴露于應激條件下的細胞產(chǎn)生的，結(jié)構(gòu)上高度保守，在原核和真核細胞中廣泛存在的一類蛋白。HSPs首次應用于描述果蠅()的熱休克反應，從此，HSPs開始受到廣泛的關(guān)注和研究(Wang, 2004; 栗振義等, 2016)。HSP在正常和應激情況下均發(fā)揮重要的生理功能，但在脅迫條件包括熱激、物理、化學和生物等脅迫因子下表達量顯著增加(齊妍等, 2013)。按照分子量的不同，HSPs分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子熱休克蛋白(Waters, 1996)。其中，HSP70是研究較多、較深入的蛋白，在逆境環(huán)境下，該蛋白具有分子伴侶的功能，參與新生肽的成熟及蛋白質(zhì)變性后的復性、降解，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而對細胞具有保護作用(劉偉等, 2012)。近年來，已從多種藻類中克隆獲得了序列，對多種藻類基因的結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)控機理等進行了研究，Muller等(1992)在研究單細胞藻萊茵衣藻()基因的結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，其不同于高等植物基因的結(jié)構(gòu)，說明在不同的生物體中，基因具有序列的多樣性。

海帶()是一種冷溫性海藻，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成成分，也是我國最早開展全人工養(yǎng)殖和育苗的經(jīng)濟海藻，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)揮重要貢獻(王飛久等, 2008)。海帶‘海天1號’是南方耐高溫品系與北方高產(chǎn)品系經(jīng)過雜交后，再通過連續(xù)自交幾代后，選育獲得的海帶新品系，其具有產(chǎn)量高、耐高溫、成熟稍早等特點(姚海芹等, 2016)。本研究以海帶‘海天1號’為材料，通過RACE方法獲得全長cDNA序列，根據(jù)序列信息研究其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，并通過熒光定量PCR分析溫度對基因表達量的影響，以期為海帶耐高溫的分子機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

2015年11月12日，海帶‘海天1號’采自山東榮成青魚灘養(yǎng)殖海域，挑選大小均勻、健康無損傷的個體，長度約為5~6 cm。將取回的海帶幼苗在溫度為13℃、光強為30~50 μmol photons/(m2·s)、光周期為12L : 12D條件下，培養(yǎng)1 d，培養(yǎng)液為含有NaNO3和KH2PO4溶液的滅菌海水，N濃度為3 mg/L，N : P= 10 : 1，充氣懸浮培養(yǎng)。在高溫(25℃)分別處理0、3、6、12、18、24、30、36 h，以0為參考，比較基因在高溫脅迫不同時間的表達情況。在不同溫度(2℃, 6℃, 10℃, 14℃, 18℃, 22℃, 25℃)時，處理3 h，以10℃為參考，比較基因在不同溫度的表達情況。

1.2 總RNA提取

采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)進行海帶總RNA的制備和提取，方法參照試劑盒說明書。制備后的RNA經(jīng)過瓊脂糖(1.2%)凝膠電泳檢測，檢查其完整性，并在A260: A280條件下，檢測總RNA的純度。

1.3 RACE法克隆Sjhsp70 cDNA全長序列

5?-RACE和3?-RACE模板采用Gene RacerTMKit (Invitrogen)進行合成。根據(jù)本實驗室轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中的海帶基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件分別設(shè)計5?-RACE引物HSP70-R1、HSP70-R2和3?-RACE引物HSP70-F1、HSP70-F2(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。所用的其他引物序列見表1。根據(jù)RACE試劑盒說明，分別使用PCR擴增得到5?末端和3?末端，采用瓊脂糖凝膠(1.5 %)電泳對PCR產(chǎn)物進行分析。確定目的條帶后切膠回收，連接于pUCm載體，進行轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑選陽性克隆，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，根據(jù)測序序列拼接獲得全長cDNA。

表1 引物名稱及序列

1.4 生物信息分析

開放閱讀框(ORF)識別：利用NCBI中的ORF Finder (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htm1)尋找基因序列完整的ORF。

蛋白質(zhì)組分分析：利用ProtParam (http://web. expasy.org/protparam/)在線工具分析HSP70蛋白性質(zhì)的基本參數(shù)。用NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/)在線工具預測蛋白磷酸化位點。

多序列比對和進化樹構(gòu)建：用BLASTP程序?qū)ふ液Щ虻耐葱蛄?，再用CLC Genomics Workbench 8軟件對獲得的同源序列進行多序列比對。根據(jù)多序列比對結(jié)果，用MEGA5.2軟件中的Neighbor- Joining法進行進化樹構(gòu)建。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測：利用CLC Genomics Workbench 8軟件進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析來預測其二級結(jié)構(gòu)及序列中含有的蛋白激酶C磷酸化位點、N端糖基化位點，并在二級結(jié)構(gòu)圖中標注。

蛋白三維結(jié)構(gòu)的預測：目標蛋白三維結(jié)構(gòu)基于同源建模的I-TASSER在線軟件(http://zhanglab.ccmb.m ed.umich.edu/I-TASSER/)進行預測。

1.5 定量PCR分析

采用qPCR技術(shù)，分析在不同溫度及不同高溫誘導下mRNA的轉(zhuǎn)錄差異，選擇α-微管蛋白(α-Tubulin)為內(nèi)參基因，與內(nèi)參基因參照引物序列見表2。熒光qPCR反應體系為2 × SYBR Green Mix，25 μl；PCR正向引物，1 μl；PCR反向引物，1 μl；模板cDNA，5 μl；ddH2O，18 μl，總反應體系為50 μl。針對每個模板的每對引物設(shè)置3個重復以及1個陰性對照。熒光定量PCR反應程序： 95℃預變性10 min后，按照95℃，30 s；53℃，30 s；72℃，1 min的反應程序進行40個循環(huán)。融解曲線反應程序：由60℃遞進升溫到95℃步進0.5℃，恒溫10 s。用2–DD法計算的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sjhsp70全長cDNA克隆及分析

利用RNeasy Plant Mini Kit提取海帶總RNA，A260: A280比值為1.92，表明所制備的海帶RNA純度較高。瓊脂糖凝膠電泳檢測28 s和18 s 2條主要條帶清晰明顯，表明獲得的海帶總RNA完整性較好(圖1A)。用特異性引物與Gene Racer引物分別進行5?-RACE和3?-RACE擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，5?-RACE PCR特異性條帶大小為250 bp左右(圖1B)，3?-RACE PCR特異性條帶大小為2000 bp左右(圖1C)，分別測序并拼接后獲得全長cDNA序列，含有一個2892 bp長的開放閱讀框，5?和3?非編碼區(qū)的長度分別為101、785 bp，Poly A尾巴信號肽區(qū)域位于3765~3770 bp處。將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號為KY986415。

2.2 SjHSP70理化性質(zhì)分析

使用ProtParam對編碼的SjHSP70蛋白進行分析，SjHSP70含有963個氨基酸，其分子量為103290.11 Da，理論等電點為4.83。該蛋白含有163個帶負電荷的氨基酸殘基和118個帶正電荷的氨基酸殘基，它的N端以甲硫氨酸起始。該蛋白脂肪族指數(shù)為79.00，疏水性指數(shù)為-0.369，不穩(wěn)定性指數(shù)為33.12，可歸類為穩(wěn)定性蛋白。

2.3 SjHSP70序列分析

對SjHSP70的氨基酸序列進行BLAST分析。結(jié)果顯示，SjHSP70與其他物種的HSP蛋白具有較高的同源性。其中，與長囊水云的HSP70蛋白的相似度達到了76.69%，與單胞藻()的HSP70蛋白相似度為44%，說明本研究獲得的基因序列確為熱休克蛋白家族的編碼基因。對SjHSP70序列進一步分析發(fā)現(xiàn)，SjHSP70包括N末端核酸結(jié)合區(qū)、底物結(jié)合區(qū)和C末端，N末端核酸結(jié)合區(qū)位于第31~418個氨基酸之間，底物結(jié)合區(qū)位于第426~598個氨基酸之間。HSP70蛋白N末端氨基酸序列高度保守，具有結(jié)合并水解ATP的活性中心。應用SignalP 4.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，SjHSP70的N端具有一段28個氨基酸的信號肽，且SjHSP70的C末端氨基酸序列為EDEL，據(jù)此判斷SjHSP70可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。

本研究得到的SjHSP70與之前報道的海帶HSP70 (Fu, 2009)相似度約為30%，其中，2個蛋白的前600個氨基酸序列相似度約為40%，說明海帶中HSP70的N端的保守性更強。為了比較SjHSP70與其他在大型海藻中報道的HSP70，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了裙帶菜()、壇紫菜()、滸苔(sp)等12種海藻的HSP70序列(圖2)，對其進行多序列比對分析發(fā)現(xiàn)， SjHSP70與長囊水云的HSP70蛋白的相似度達到了76.69%，與其他大型海藻的HSP70相似度在30%~ 40%之間，進化樹顯示，SjHSP70與長囊水云HSP70聚為單獨的一枝，與其他海藻中的HSP70的距離較遠。

表2 Sjhsp70定量PCR引物與內(nèi)參基因引物序列

圖1 Sjhsp70總RNA和RACE電泳

A：海帶總RNA電泳；B：5?-RACE PCR電泳； C：3?-RACE PCR電泳；M：DNA分子量標準；泳道1：5?-RACE PCR電泳結(jié)果；泳道2：3?-RACE PCR電泳結(jié)果

A: Total RNA electrophoresis patterns; B: 5?-RACE PCR electrophoresis patterns; C: 3?-RACE PCR electrophoresis patterns; Lane M：DL5000 Marker; Lane 1:70 5?-RACE PCR results; Lane 2:3?-RACE PCR results

2.4 SjHSP70蛋白結(jié)構(gòu)分析

應用CLC Genomics Workbench軟件進行SjHSP70蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測，該蛋白由963個氨基酸組成，包含35個α螺旋和25個β折疊。氨基酸序列中的蛋白激酶C磷酸化位點和糖基化位點見圖3。從圖3可以看出，應用NetPhos工具預測蛋白質(zhì)中絲氨酸、蘇氨酸和絡(luò)氨酸的磷酸化位點，在HSP70蛋白質(zhì)中共預測出23個絲氨酸磷酸化位點，12個蘇氨酸磷酸化位點和8個絡(luò)氨酸磷酸化位點。

海帶SjHSP70和釀酒酵母() HSP110分別有963和650個氨基酸，釀酒酵母HSP110蛋白在PDB數(shù)據(jù)庫里的ID為3C7N。海帶SjHSP70的三維結(jié)構(gòu)(圖4)是以3C7N為模板在I-TASSER軟件上預測的，該蛋白從紅色的碳端到藍色的氮端，蛋白結(jié)構(gòu)C值為–2.28，表示其與3C7N的A鏈在折疊和二級結(jié)構(gòu)方面非常類似。目標蛋白SjHSP70和模板蛋白釀酒酵母HSP110結(jié)構(gòu)相似性的TM值和RMSD分別為0.662和0.96?。

2.5 溫度誘導下Sjhsp70基因的轉(zhuǎn)錄分析

用熒光定量PCR對基因受高溫(25℃)脅迫在不同時間和不同溫度時，處理3 h的轉(zhuǎn)錄水平進行分析，結(jié)果見圖5和圖6。從圖5可以看出，高溫(25℃)脅迫時，24 h內(nèi)隨著脅迫時間的延長，的表達量逐漸提高，在24 h時達到表達量的最大值，12 h前增加速度較快，12~24 h間增加速度緩慢，24 h后表達量逐漸降低，原因可能是的表達具有時效性，在溫度脅迫短期時間內(nèi)大量表達，長時間脅迫會超出海帶自身的調(diào)控能力，從而導致表達量降低。

從圖6可以看出，不同溫度處理海帶幼孢子體，轉(zhuǎn)錄受到明顯的影響，以海帶生長的適宜溫度10℃為參考，溫度小于10℃和大于10℃都會使得轉(zhuǎn)錄上調(diào)，小于10℃時，上調(diào)不顯著，大于10℃時，溫度越高表達量越高，25℃時表達量最高，高溫脅迫比低溫脅迫對表達的影響更顯著。

圖2 基于HSP70氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹

圖3 SjHSP70蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測及功能位點注釋

圖4 SjHSP70蛋白的預測三維結(jié)構(gòu)圖及其與模板碳主鏈的重疊

A：SjHSP70的三維結(jié)構(gòu)；B：SjHSP70結(jié)構(gòu)和釀酒酵母HSP110蛋白碳主鏈的重疊。彩色結(jié)構(gòu)的是海帶HSP70；紫色線是釀酒酵母HSP110碳主鏈

A: Predicted 3D structure model of SjHSP70; B: Superimposed prediction model and native cartoon structures of SjHSP70 and HSP110 of. Rainbow structure was represen ted of the SjHSP70. Purple line is displayed using the alpha carbon backbone trace ofHSP110

圖5 Sjhsp70在高溫(25℃)誘導下的轉(zhuǎn)錄水平變化

注：不同字母表示差異顯著(<0.05)

Note: Different letters represent significant difference (<0.05)

3 討論

大量研究表明，基因在調(diào)控植物抗逆過程中發(fā)揮重要作用，植物在受到不利條件，如高溫逆境脅迫時，會上調(diào)的表達量，增強對高溫脅迫的抵抗力，其機制可能是HSP70 蛋白可以參與新生蛋白折疊、穩(wěn)定蛋白正常構(gòu)象以及協(xié)助變性蛋白降解等(Wang, 2004; 王明強等, 2015)。Fu等(2009)研究表明，海帶中基因表達受溫度調(diào)控。本實驗室在之前的海帶轉(zhuǎn)錄譜研究發(fā)現(xiàn)，多個基因在高溫脅迫下表達上調(diào)(Liu, 2014)。本研究克隆了其中的1個基因，該基因編碼的SjHSP70蛋白含有963個氨基酸。與之前報道的海帶中HSP70蛋白(Fu, 2009)相比，多出306個氨基酸。二者都具有HSP70蛋白特有的核酸結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、底物結(jié)合區(qū)以及C末端區(qū)，其中，在N端尤其是ATP結(jié)合位點位區(qū)，二者相似度高，在鉸鏈區(qū)、底物結(jié)合區(qū)和C末端，二者的相似度較低。本研究獲得SjHSP70初步判定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而之前報道的海帶HSP70 (Fu, 2009)是胞質(zhì)蛋白，二者可能具有不同的生理功能，作用的底物可能不同，故二者底物結(jié)合區(qū)的相似性較低。

圖6 Sjhsp70在不同溫度下的轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)HSP70的表達類型，可分為組成型 HSP70和誘導型HSP70，前者在正常條件下就有本底表達，以維持細胞正常生命活動的需要，而后者在受環(huán)境因素脅迫時誘導表達(Swindell, 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在正常生長條件下有微量表達，受到高溫和低溫誘導時，都會表達上調(diào)，尤其是受到高溫脅迫時，表達量會大幅增加，25℃時的表達量是10℃的21倍之多。在受到高溫脅迫(25℃)時，24 h后表達量達到頂峰，超過24 h后，表達量又開始降低。之前報道青島養(yǎng)殖的海帶受到熱激處理時，其在25℃處理7 h后，表達量即可達到最大值(Fu, 2009)。二者差異的原因，可能是‘海天1號’的高溫耐受性比青島地區(qū)養(yǎng)殖海帶的高溫耐受性強，可以在高溫脅迫下，持續(xù)高表達熱休克蛋白，以提高自身的耐受性。

本研究克隆獲得了1個海帶基因，定量了該基因在海帶高溫脅迫時的表達特征，并探討了其對調(diào)控海帶高溫耐受性的作用。下一步工作將繼續(xù)研究在具有不同高溫耐受性海帶材料中的序列多樣性，同時，分析序列多樣性與高溫耐受性之間的相關(guān)性，相關(guān)結(jié)果將為海帶耐高溫機制的研究提供重要的理論依據(jù)，也為海帶耐高溫新品種的培育打下基礎(chǔ)。

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(編輯 陳嚴)

Cloning, Bioinformatics and Quantitative Expression Analysis ofin

YUAN Yanmin1,2, LIU Fuli2,3①, LIANG Zhourui2, WANG Wenjun2, SUN Xiutao2, WANG Feijiu2

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071;3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao), Qingdao 266071)

HSP70s are heat shock proteins that exist widely in prokaryotes and eukaryotes, and play important roles in biological resistance.The full cDNA sequence of agene in() of 3778 bp was obtained by RACE technology.consisted of an open reading frame (ORF) of 2892 bp, a 5? untranslated region (UTR) of 101 bp, and a 3? UTR of 785 bp. Analysis of amino acid content and physicochemical properties showed that SjHSP70 is a stable protein. Comparison between the amino acid sequences of SjHSP70 and the well-characterized orthologous HSP70 proteins from various species indicated that SjHSP70 shares the highest similarity with the orthologous protein from. The phylogenetic tree of the examined proteins indicated that SjHSP70 formed a group with a HSP70 from. Secondary structure analysis of SjHSP70 showed thatit is composed of 35 α-helices and 25 β-strands. Three-dimensional homology structure modeling of SjHSP70 was predicted by the I-TASSER server according to the 3C7N template. Overall, the folding and secondary structures of SjHSP70 were highly similar to those of 3C7N.To study the correlation between SjHSP70 and the resistance to high-temperature stress in, real-time variation in the expression ofunder different temperatures and different stress times was determined. The results showed that high temperature had a significant effect on the expression of. The expression ofcontinued to increase with increase in temperature, with the maximumexpression at 25℃ after 24 h of high-temperature stress. This result indicates thatis probably related to high-temperature resistance in. This study provides a foundation for the characterization of SjHSP70 and for the study of SjHSP70 function in the high-temperature stress response in.

‘Haitian No.1’; HSP70; RACE;Bioinformatics analysis;Quantitative real-time PCR

LIU Fuli, E-mail: liufl@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20170407001

Q75; S917

A

2095-9869(2018)04-0152-07

* 中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項(2016PT03)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系藻類體系離岸式養(yǎng)殖崗位專項(CARS-50)和青島市民生科技計劃項目(17-3-3-65-nsh)共同資助[This work was supported by the Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS(2016PT03), China Agricultural Research System-Algae Offshore Aquaculture (CARS-50), and Qingdao City Science and Technology Project (17-3-3-65-nsh)]. 袁艷敏，E-mail: yuanym2991@163.com

劉福利，副研究員，E-mail: liufl@ysfri.ac.cn

2017-04-07,

2017-05-08

袁艷敏, 劉福利, 梁洲瑞, 汪文俊, 孫修濤, 王飛久. 海帶基因的克隆、分析及轉(zhuǎn)錄水平定量研究. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(4): 152–158

Yuan YM, Liu FL, Liang ZR, Wang WJ, Sun XT, Wang FJ. Cloning, bioinformatics and quantitative expression analysis ofin. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 152–158